[發明專利]一種酶法轉化生產9α-羥基雄甾-4-烯-3;17-二酮的方法

有效

• 申請號: 201711352434.8
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN107955827B
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 饒志明;沙宗焱;張顯;楊套偉;徐美娟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P33/06
• 分類號: C12P33/06;C12N9/02;C12N15/70
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種酶法轉化生產9α?羥基雄甾?4?烯?3,17?二酮的方法，屬于基因工程和酶工程領域。本發明將來源于Mycobacterium sp.Strain VKMAc?1817D的3?甾酮9α?羥基化酶的氧化亞基KshA，還原亞基KshB，及未知活性亞基KshC成功在E.coliBL21中表達，并鑒定出KshC為氧化亞基，且酶活遠高于KshA。利用本實驗室已構建的BL21/pET?28a(+)?fdh表達甲酸脫氫酶FDH，以KSH(KshB+KshC)和FDH工程菌的粗酶液作為生物催化劑，以甾體化合物AD為底物，同時確定了最佳反應溫度為30℃，pH7.0。在最優條件下轉化AD生成產物9?OH?AD，在20小時內，9?OH?AD的產量為4.7g/L，摩爾轉化率達到96.7％。本發明產生9?OH?AD實現了3?甾酮9α?羥基化酶羥化系統與輔酶循環體系的偶聯，具有效率高，成本低，綠色環保等優點。

技術領域

本發明涉及一種酶法轉化生產9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，屬于基因工程和酶工程領域。

背景技術

甾體化合物是廣泛存在于生物體組織內的一類重要的天然有機化合物，由于甾體類藥物具有多種生理功能并發揮獨特療效，故在臨床上有廣泛的應用，是僅次于抗生素的第二大類藥物，年增長率在15％以上。甾類化合物通常具有一系列獨特的生理功能，這主要是由于甾體化合物母核上取代基、雙鍵位置或立體構型的不同。甾類化合物擁有類似的結構且結構復雜數目繁多，普遍存在于動、植物組織和某些微生物中，比較常見的有動物組織中的膽固醇、膽酸、性激素、腎上腺皮質激素、孕酮和雄酮等植物中的薯預皂素和谷甾醇等以及酵母細胞中的麥角固醇等。

9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)化學結構上9-羥基的存在，可借助常規甾體化學合成手段形成C9，11-雙鍵體系，從而很方便地在C9位引入一個鹵素原子形成糖皮質激素必不可缺少的功能羥基。9α-OH-AD是一種重要的甾體藥物中間體，其9α位作為被羥基化的位點，在進行簡單的鹵化反應后便可引入F或Cl等鹵素取代基，從而有效提升某些皮質類激素(如地塞米松、倍他米松、糠酸莫米松及氯地米松等藥物)的藥效，工藝流程的實現可根本解決目前工業生產中存在的C11α-羥基化轉化率低、副產物多的問題，具有極高的商業價值。

3-甾酮9α-羥基化酶(3-ketosteroid-9-alpha-hydroxylase(KSH))是甾體微生物代謝的一個關鍵酶，該酶在微生物中廣泛存在，例如紅球菌屬Rhodococcus，諾卡氏菌屬Nocardia，節桿菌屬Arthrobacter，分枝桿菌屬Mycobacteriu。3-甾酮9α-羥基化酶系統是一個雙組分酶，由KshA(3-甾酮9α-羥基化酶氧化酶)和KshB(3-甾酮9α-羥基化酶還原酶)組成，由基因kshA和kshB分別編碼KshA和KshB，這一點最早在Rhodococcus erythropolisSQ1中獲得證實，且對Rhodococcus erythropolis SQ1所進行的基因敲除研究表明，kshA和kshB都是KSH表達所必需的組分。KshB是3-甾酮9α-羥基化酶系統的還原組件，它負責將來自NADH的還原力傳遞給KshA，使其從氧化態重新回到還原態并不斷地在甾體的相應位置產生羥基化反應，另外，KshB是一個多功能酶，它不僅僅在3-甾酮9α-羥基化酶系統中發揮作用，在生物體內其他需要還原力的地方也發揮著重要的作用。

甲酸脫氫酶(FDH)能催化甲酸分解生成CO₂，同時將NAD⁺還原生成NADH，可與3-甾酮9α-羥基化酶系統結合。大量研究表明，FDH是最好的NADH再生酶，在手性化合物的合成中具有獨特的優勢：(1)FDH催化的反應不可逆，主反應產物回收率可達99％以上；(2)底物甲酸根離子較廉價，產物CO₂易從體系中逃逸，簡化分離純化步驟；(3)FDH在較寬的耐受性，此反應只產生一種副產物-CO₂，而CO₂對任何酶的活性均沒有任何影響，且反應完全，同時CO₂作為一種氣體，很容易從反應體系中逃逸出來。

發明內容