[發(fā)明專利]一種酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)9α-羥基雄甾-4-烯-3;17-二酮的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711352434.8
• 申請(qǐng)日: 2017-12-15
• 公開（公告）號(hào): CN107955827B
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 饒志明;沙宗焱;張顯;楊套偉;徐美娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P33/06
• 分類號(hào): C12P33/06;C12N9/02;C12N15/70
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)9α?羥基雄甾?4?烯?3,17?二酮的方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明將來(lái)源于Mycobacterium sp.Strain VKMAc?1817D的3?甾酮9α?羥基化酶的氧化亞基KshA，還原亞基KshB，及未知活性亞基KshC成功在E.coliBL21中表達(dá)，并鑒定出KshC為氧化亞基，且酶活遠(yuǎn)高于KshA。利用本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的BL21/pET?28a(+)?fdh表達(dá)甲酸脫氫酶FDH，以KSH(KshB+KshC)和FDH工程菌的粗酶液作為生物催化劑，以甾體化合物AD為底物，同時(shí)確定了最佳反應(yīng)溫度為30℃，pH7.0。在最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)化AD生成產(chǎn)物9?OH?AD，在20小時(shí)內(nèi)，9?OH?AD的產(chǎn)量為4.7g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到96.7％。本發(fā)明產(chǎn)生9?OH?AD實(shí)現(xiàn)了3?甾酮9α?羥基化酶羥化系統(tǒng)與輔酶循環(huán)體系的偶聯(lián)，具有效率高，成本低，綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甾體化合物是廣泛存在于生物體組織內(nèi)的一類重要的天然有機(jī)化合物，由于甾體類藥物具有多種生理功能并發(fā)揮獨(dú)特療效，故在臨床上有廣泛的應(yīng)用，是僅次于抗生素的第二大類藥物，年增長(zhǎng)率在15％以上。甾類化合物通常具有一系列獨(dú)特的生理功能，這主要是由于甾體化合物母核上取代基、雙鍵位置或立體構(gòu)型的不同。甾類化合物擁有類似的結(jié)構(gòu)且結(jié)構(gòu)復(fù)雜數(shù)目繁多，普遍存在于動(dòng)、植物組織和某些微生物中，比較常見的有動(dòng)物組織中的膽固醇、膽酸、性激素、腎上腺皮質(zhì)激素、孕酮和雄酮等植物中的薯預(yù)皂素和谷甾醇等以及酵母細(xì)胞中的麥角固醇等。

9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)化學(xué)結(jié)構(gòu)上9-羥基的存在，可借助常規(guī)甾體化學(xué)合成手段形成C9，11-雙鍵體系，從而很方便地在C9位引入一個(gè)鹵素原子形成糖皮質(zhì)激素必不可缺少的功能羥基。9α-OH-AD是一種重要的甾體藥物中間體，其9α位作為被羥基化的位點(diǎn)，在進(jìn)行簡(jiǎn)單的鹵化反應(yīng)后便可引入F或Cl等鹵素取代基，從而有效提升某些皮質(zhì)類激素(如地塞米松、倍他米松、糠酸莫米松及氯地米松等藥物)的藥效，工藝流程的實(shí)現(xiàn)可根本解決目前工業(yè)生產(chǎn)中存在的C11α-羥基化轉(zhuǎn)化率低、副產(chǎn)物多的問(wèn)題，具有極高的商業(yè)價(jià)值。

3-甾酮9α-羥基化酶(3-ketosteroid-9-alpha-hydroxylase(KSH))是甾體微生物代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶，該酶在微生物中廣泛存在，例如紅球菌屬Rhodococcus，諾卡氏菌屬Nocardia，節(jié)桿菌屬Arthrobacter，分枝桿菌屬M(fèi)ycobacteriu。3-甾酮9α-羥基化酶系統(tǒng)是一個(gè)雙組分酶，由KshA(3-甾酮9α-羥基化酶氧化酶)和KshB(3-甾酮9α-羥基化酶還原酶)組成，由基因kshA和kshB分別編碼KshA和KshB，這一點(diǎn)最早在Rhodococcus erythropolisSQ1中獲得證實(shí)，且對(duì)Rhodococcus erythropolis SQ1所進(jìn)行的基因敲除研究表明，kshA和kshB都是KSH表達(dá)所必需的組分。KshB是3-甾酮9α-羥基化酶系統(tǒng)的還原組件，它負(fù)責(zé)將來(lái)自NADH的還原力傳遞給KshA，使其從氧化態(tài)重新回到還原態(tài)并不斷地在甾體的相應(yīng)位置產(chǎn)生羥基化反應(yīng)，另外，KshB是一個(gè)多功能酶，它不僅僅在3-甾酮9α-羥基化酶系統(tǒng)中發(fā)揮作用，在生物體內(nèi)其他需要還原力的地方也發(fā)揮著重要的作用。

甲酸脫氫酶(FDH)能催化甲酸分解生成CO₂，同時(shí)將NAD⁺還原生成NADH，可與3-甾酮9α-羥基化酶系統(tǒng)結(jié)合。大量研究表明，F(xiàn)DH是最好的NADH再生酶，在手性化合物的合成中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：(1)FDH催化的反應(yīng)不可逆，主反應(yīng)產(chǎn)物回收率可達(dá)99％以上；(2)底物甲酸根離子較廉價(jià)，產(chǎn)物CO₂易從體系中逃逸，簡(jiǎn)化分離純化步驟；(3)FDH在較寬的耐受性，此反應(yīng)只產(chǎn)生一種副產(chǎn)物-CO₂，而CO₂對(duì)任何酶的活性均沒有任何影響，且反應(yīng)完全，同時(shí)CO₂作為一種氣體，很容易從反應(yīng)體系中逃逸出來(lái)。

發(fā)明內(nèi)容