[發明專利]一種酶法轉化生產9α-羥基雄甾-4-烯-3;17-二酮的方法

有效

• 申請號: 201711352434.8
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN107955827B
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 饒志明;沙宗焱;張顯;楊套偉;徐美娟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P33/06
• 分類號: C12P33/06;C12N9/02;C12N15/70
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種轉化雄甾-4-烯-3,17-二酮生成9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮的組合物，其特征在于，所述組合物包括由3-甾酮9α-羥基化酶還原亞基KshB和3-甾酮9α-羥基化酶氧化亞基KshC組成的3-甾酮9α-羥基化酶混合酶液；編碼所述3-甾酮9α-羥基化酶還原亞基KshB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；編碼所述3-甾酮9α-羥基化酶氧化亞基KshC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包括輔酶NAD⁺、NADH、甲酸脫氫酶或三者的任意組合。

3.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述3-甾酮9α-羥基化酶還原亞基KshB的氨基酸序列為SEQ ID NO.4。

4.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述3-甾酮9α-羥基化酶氧化亞基KshC的氨基酸序列為SEQ ID NO.5。

5.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物為由3-甾酮9α-羥基化酶還原亞基KshB和3-甾酮9α-羥基化酶氧化亞基KshC組成的3-甾酮9α-羥基化酶混合酶液、NADH和甲酸脫氫酶組成。

6.根據權利要求5所述的組合物，其特征在于，所述3-甾酮9α-羥基化酶氧化亞基KshC、3-甾酮9α-羥基化酶還原亞基KshB與甲酸脫氫酶按酶活添加比例為1～10:1～10:1～10。

7.根據權利要求5所述的組合物，其特征在于，所述NADH的添加量為0.01～1mol/L。

8.權利要求1所述的組合物的制備方法，其特征在于，所述方法具體是：

(1)以SEQ ID NO.2所示核酸序列為模板，擴增得到編碼3-甾酮9α-羥基化酶還原亞基KshB的基因，將其克隆到大腸桿菌表達載體pET-28a上，獲得重組質粒pET-28a-kshB；

(2)以SEQ ID NO.3所示核酸序列為模板，擴增得到編碼3-甾酮9α-羥基化酶氧化亞基KshC的基因，將其克隆到大腸桿菌表達載體pET-Duet1(+)上，獲得重組質粒pET-Duet1(+)-kshC；

(3)將步驟(1)和步驟(2)的重組質粒分別轉化至大腸桿菌中獲得重組大腸桿菌BL21/pET-28a(+)-kshB和BL21/pET-Duet1(+)-kshC；

(4)利用步驟(3)的重組大腸桿菌發酵獲得3-甾酮9α-羥基化酶還原亞基KshB和3-甾酮9α-羥基化酶氧化亞基KshC組成的3-甾酮9α-羥基化酶混合酶液。

9.一種提高雄甾-4-烯-3,17-二酮轉化生成9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮效率的方法，所述方法是利用權利要求1所述的組合物作為催化劑，進行生物轉化。

10.權利要求1所述的組合物在生產甾體化合物領域的應用。