[發(fā)明專利]一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)牛筋草的遺傳轉(zhuǎn)化方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711351411.5
• 申請(qǐng)日: 2017-12-15
• 公開（公告）號(hào): CN108103093A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳勇;沈雪峰;楊九鈴;董朝霞;魏吉平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗;裘暉

本發(fā)明公開一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)牛筋草的遺傳轉(zhuǎn)化方法，屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次建立了一種牛筋草的遺傳轉(zhuǎn)化體系方法，包括愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代、轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)分化、生根篩選培養(yǎng)和煉苗移栽、轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測等步驟。該方法優(yōu)點(diǎn)在于：(1)愈傷組織誘導(dǎo)率高，為遺傳轉(zhuǎn)化提供了大量的受體材料。(2)經(jīng)過采用壓力篩選培養(yǎng)基對(duì)抗性愈傷進(jìn)行篩選和GUS鑒定對(duì)抗性植株進(jìn)行篩選，簡化了實(shí)驗(yàn)過程，大大減少了轉(zhuǎn)化后的工作量。(3)利用傳統(tǒng)的單子葉遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得了穩(wěn)定、高效的一種牛筋草遺傳轉(zhuǎn)化體系方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)牛筋草的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

牛筋草(Eleusineindica)是禾本科一年生雜草，不僅分布廣泛、適應(yīng)能力強(qiáng)的特點(diǎn)，而且具有強(qiáng)的繁殖能力、分蘗能力強(qiáng)，已成為世界十大惡性雜草之一。由于除草劑的長期大量使用，目前已有265種雜草對(duì)15類除草劑產(chǎn)生了抗藥性，而牛筋草已對(duì)7類除草劑產(chǎn)生了多重抗性。近年來，遺傳轉(zhuǎn)化法為抗病蟲草害的研究提供了重要的技術(shù)手段。

迄今為止，有關(guān)牛筋草遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究還未曾報(bào)道，這大大地限制了牛筋草抗藥性研究的發(fā)展。所以，建立一種穩(wěn)定、高效的牛筋草遺傳轉(zhuǎn)化體系，是研究牛筋草抗藥性遺傳機(jī)理的重要的方法手段。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)牛筋草的遺傳轉(zhuǎn)化方法。該方法高效穩(wěn)定，以成熟的敏感型牛筋草種子為外植體，建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)牛筋草的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟：

(1)愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代：牛筋草種子去皮，-20℃冷凍20～30d后，于75％酒精浸泡，用0.05％～0.2％HgCl2消毒滅菌10～20min后，在無菌條件下，用無菌水反復(fù)清洗，風(fēng)干，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基IC中；30～40d后，將產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基AC中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每30～40d繼代一次，繼代2～ 3次；再進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3～4d，選取淡黃色、結(jié)構(gòu)緊湊、顆粒狀的胚性愈傷組織作為后續(xù)的材料；培養(yǎng)條件：25±2℃、24h黑暗。

(2)轉(zhuǎn)化：將步驟(1)預(yù)培養(yǎng)得到的胚性愈傷組織低溫處理后，接入 OD600＝0.4～0.6的目的農(nóng)桿菌懸浮液中，“二次間歇抽真空”浸染，使農(nóng)桿菌充分吸附到外植體上；將感染后的愈傷組織移至滅菌濾紙上，吸去表面液體后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基CC上，進(jìn)行共培養(yǎng)2～3d；取出共培養(yǎng)后的愈傷組織，脫菌、風(fēng)干后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基SC1中篩選，30～40d后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基SC2上篩選；培養(yǎng)條件：25℃±2℃、24h黑暗培養(yǎng)。

(3)誘導(dǎo)分化：將步驟(2)篩選培養(yǎng)得到的愈傷組織，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基DC中，進(jìn)行分化培養(yǎng)。

(4)生根篩選培養(yǎng)和煉苗移栽：待不定芽長到4～6cm時(shí)，轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基RC中；待幼苗根系發(fā)達(dá)時(shí)，煉苗，洗凈根部瓊脂凝膠，剪取轉(zhuǎn)基因苗葉片和根部大約2～4cm，進(jìn)行牛筋草組織GUS染色，將陽性苗移至基質(zhì)中，12h 光照培養(yǎng)。

(5)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測：提取步驟(4)得到的陽性苗的基因組DNA，針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)引物，采用PCR技術(shù)鑒定是否可擴(kuò)增出目的基因片段，若鑒定成功，即得到牛筋草轉(zhuǎn)基因植株。

所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基IC：N6+0.5～2mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+ (30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1瓊脂，pH＝5.8±0.1。