[發(fā)明專利]一種根癌農(nóng)桿菌介導牛筋草的遺傳轉化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711351411.5
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108103093A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 陳勇;沈雪峰;楊九鈴;董朝霞;魏吉平
• 申請（專利權）人: 華南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 廣州市華學知識產(chǎn)權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗;裘暉

1.一種根癌農(nóng)桿菌介導牛筋草的遺傳轉化方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)愈傷組織的誘導和繼代：牛筋草種子去皮，-20℃冷凍20～30d后，于75％酒精浸泡，用0.05％～0.2％HgCl2消毒滅菌10～20min后，在無菌條件下，用無菌水反復清洗，風干，接入誘導培養(yǎng)基IC中；30～40d后，將產(chǎn)生的愈傷組織轉入繼代培養(yǎng)基AC中進行繼代培養(yǎng)，每30～40d繼代一次，繼代2～3次；再進行預培養(yǎng)3～4d，選取淡黃色、結構緊湊、顆粒狀的胚性愈傷組織作為后續(xù)的材料；培養(yǎng)條件：25±2℃、24h黑暗；

(2)轉化：將步驟(1)預培養(yǎng)得到的胚性愈傷組織低溫處理后，接入OD600＝0.4～0.6的目的農(nóng)桿菌懸浮液中，“二次間歇抽真空”浸染，使農(nóng)桿菌充分吸附到外植體上；將感染后的愈傷組織移至滅菌濾紙上，吸去表面液體后轉入共培養(yǎng)培養(yǎng)基CC上，進行共培養(yǎng)2～3d；取出共培養(yǎng)后的愈傷組織，脫菌、風干后轉入篩選培養(yǎng)基SC1中篩選，30～40d后轉入篩選培養(yǎng)基SC2上篩選；培養(yǎng)條件：25℃±2℃、24h黑暗培養(yǎng)；

(3)誘導分化：將步驟(2)篩選培養(yǎng)得到的愈傷組織，轉接到分化培養(yǎng)基DC中，進行分化培養(yǎng)；

(4)生根篩選培養(yǎng)和煉苗移栽：待不定芽長到4～6cm時，轉入生根篩選培養(yǎng)基RC中；待幼苗根系發(fā)達時，煉苗，洗凈根部瓊脂凝膠，剪取轉基因苗葉片和根部2～4cm，進行牛筋草組織GUS染色，將陽性苗移至基質(zhì)中，12h光照培養(yǎng)；

(5)轉基因植株的PCR檢測：提取步驟(4)得到的陽性苗的基因組DNA，針對目的基因設計引物，采用PCR技術鑒定是否擴增出目的基因片段，若鑒定成功，即得到牛筋草轉基因植株。

2.根據(jù)權利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導牛筋草的遺傳轉化方法，其特征在于：所述的誘導培養(yǎng)基IC：N6+0.5～2mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1瓊脂，pH＝5.8±0.1。

3.根據(jù)權利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導牛筋草的遺傳轉化方法，其特征在于：所述的繼代培養(yǎng)基AC：N6+0.25～1mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+3～4g·L-1植物凝膠+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1瓊脂，pH＝5.8±0.1。

4.根據(jù)權利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導牛筋草的遺傳轉化方法，其特征在于：

所述的共培養(yǎng)培養(yǎng)基CC：誘導培養(yǎng)基IC+100～300μmol·L-1乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1。

5.根據(jù)權利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導牛筋草的遺傳轉化方法，其特征在于：所述的篩選培養(yǎng)基SC1：誘導培養(yǎng)基IC+25～30mg·L-1潮霉素+300～400mg·L-1羧芐青霉素，pH＝6.0±0.1。

6.根據(jù)權利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導牛筋草的遺傳轉化方法，其特征在于：所述的篩選培養(yǎng)基SC2：誘導培養(yǎng)基IC+15～20mg·L-1潮霉素+200～300mg·L-1羧芐青霉素；pH＝6.0±0.1。