[發明專利]采用線性洗脫步驟的重組融合蛋白純化方法

有效

• 申請號: 201711351111.7
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN109929027B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 趙燕燕;陶文杰;劉麗麗;王鑫;王廣珺
• 申請（專利權）人: 山東博安生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/71
• 分類號: C07K14/71;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/36
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 孫占華;馮沖

1.一種VEGF捕獲劑融合蛋白的純化方法，由以下步驟組成：

(1)Protein A親和層析

用含鹽的平衡緩沖液對親和層析柱MabSuRe LX進行平衡，將含有由SEQ ID NO:1編碼的VEGF捕獲劑融合蛋白的細胞培養上清進行上樣，使所述融合蛋白吸附于Protein A親和層析介質上，上樣結束后用所述含鹽的平衡緩沖液進行沖洗，再用不含鹽的緩沖液對蛋白進行洗脫，收集洗脫液；

(2)陰離子交換層析

用含鹽的平衡緩沖液對陰離子交換層析柱QFF進行平衡，將步驟(1)處理后的洗脫液調節至pH8.30-8.50后進行上樣，使融合蛋白吸附于陰離子交換層析介質上，上樣結束后用Tris緩沖液進行沖洗，再用Bis-Tris緩沖液對蛋白進行洗脫，收集洗脫液；

(3)陽離子交換層析

用Tris-MES平衡緩沖液對陽離子交換層析柱Capto S Impact進行平衡，將從步驟(2)收集的洗脫液調節至與平衡緩沖液一致后進行上樣，使所述融合蛋白吸附于陽離子交換層析介質上，上樣結束后用平衡緩沖液進行沖洗，此后進行線性洗脫，收集洗脫液；其中，所述線性洗脫以23-100％洗脫緩沖液、4-10個柱體積的方式進行；

所述線性洗脫過程使用上樣緩沖液和洗脫緩沖液，所述上樣緩沖液pH值是5.80-5.90，并包含濃度為50mM/L的MES，濃度為50mM/L的NaCl；所述洗脫緩沖液pH值是5.80-5.90，并包含濃度為50mM/L的MES，濃度為220mM/L的NaCl；

其中，在所述步驟(1)Protein A親和層析中，所述含鹽的平衡緩沖液是NaH₂PO₄平衡緩沖液，其中NaH₂PO₄濃度為20mM/L，NaCl的濃度為110mM/L，該緩沖液的pH值是6.8-7.2；

其中，在所述步驟(1)Protein A親和層析中，所述不含鹽的緩沖液為甘氨酸緩沖液，其中甘氨酸濃度為100mM/L，該緩沖液的pH值是2.8-3.0；

其中，在所述步驟(2)陰離子交換層析中，所述含鹽的平衡緩沖液是Tris平衡緩沖液，其含有50mM/L Tris，50mM/L NaCl，該平衡緩沖液的pH值是8.30-8.50；

其中，在所述步驟(2)陰離子交換層析中，所述Tris緩沖液的pH值是8.30-8.50，濃度為50mM/L；所述Bis-Tris緩沖液的pH值是5.8-6.1，濃度為50mM/L；

其中，在所述步驟(3)陽離子交換層析中，所述Tris-MES平衡緩沖液中，Tris濃度為50mM/L，MES濃度是50mM/L，NaCl濃度是50Mm/L。

2.如權利要求1所述的純化方法，其中，在所述步驟(3)陽離子交換層析中，所述上樣緩沖液和所述洗脫緩沖液的pH值都是5.90。

3.如權利要求1所述的純化方法，其中，所述線性洗脫以23-100％洗脫緩沖液、7-10個柱體積的方式進行。

4.如權利要求1所述的純化方法，其中，在所述步驟(2)陰離子交換層析中，所述洗脫液調節至pH8.40進行上樣。