[發明專利]采用線性洗脫步驟的重組融合蛋白純化方法

有效

• 申請號: 201711351111.7
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN109929027B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 趙燕燕;陶文杰;劉麗麗;王鑫;王廣珺
• 申請（專利權）人: 山東博安生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/71
• 分類號: C07K14/71;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/36
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 孫占華;馮沖

本發明涉及一種VEGF捕獲劑融合蛋白的純化方法，其包括以下步驟：(1)Protein A親和層析；(2)陰離子交換層析；和(3)陽離子交換層析。本發明的純化方法很好的避免在陽離子交換層析中洗脫蛋白過程中發生蛋白聚集，從而很大程度減少了純化方法的步驟。

技術領域

本發明涉及利用重組DNA技術生產基因工程藥物，尤其是一種重組血管內皮生長因子受體-抗體融合蛋白的純化方法。

背景技術

蛋白質通常稱為“生物制品”，在今天的醫藥領域中起重要作用。為了保證生物藥劑對人類的安全性，必須特異性地去除可能引起嚴重危害的核酸、病毒和宿主細胞蛋白質等雜質。另外，藥監局對人用蛋白質的質量要求標準很高。人用生物制品其最大的挑戰之一是在商品化規模上開發具有成本效益和有效的蛋白質純化方法。

通常，使用經過基因工程改造能產生感興趣的蛋白質的哺乳動物或細菌細胞系，通過插入一種含有該蛋白質基因的重組質粒，經過細胞培養來產生蛋白質。獲得含有感興趣蛋白質的澄清溶液后，通常嘗試聯合應用不同層析技術來將其與細胞產生的其它蛋白質分離。這些技術根據蛋白質的電荷、疏水程度、或大小來分離蛋白質混合物。這些技術中的每一種都可采用數種不同的層析樹脂，這使得可對涉及的具體蛋白質制定專用的純化方案。

血管內皮生長因子(VEGF)是多種腫瘤與血管性眼底疾病的重要治療靶點，通過與特異性受體——血管內皮生長因子受體(VEGFR)結合刺激新生血管的形成。

以VEGF為靶點的藥物阿柏西普(Aflibercept)，稱為VEGF捕獲劑融合蛋白是一種重組融合蛋白，現有技術是由人血管內皮細胞生長因子(VEGFR)受體的結合區與人免疫球蛋白G1的可結晶片段(Fc)融合而成。其結構較為復雜，二硫鍵和糖基化位點較多，其中含有較多的堿性電荷異構體，給下游純化工作帶來很大困難。

中國專利申請(公開號CN104853763A)對該融合蛋白進行了描述，并提供了其單體的氨基酸序列。若要將該蛋白純化為藥用級別，需要四個色譜分析步驟：蛋白質A親和色譜法、陽離子交換色譜法、陰離子交換色譜法和疏水作用色譜法。而這些繁雜的純化過程無疑會增加藥物的生產成本。該專利申請全文以引用的方式并入本文作為參考。

然而，本申請的發明人發現，此方法在陽離子交換層析步驟之后發生了蛋白凝集現象，并且更換緩沖液和洗脫液無法避免該現象的發生，而需要進行后續處理進一步去除凝集的蛋白，以使純化之后的產物達到質量標準。

令人驚奇的是，本申請的發明人發現，在將陽離子交換層析步驟中，將洗脫方式由等度洗脫改為線性洗脫后，得到的洗脫液中不發生蛋白聚集的現象，并且收獲的體積也小于等度洗脫，大幅減少了純化工藝所需要進行的步驟的同時，為工藝中下一步的超濾濃縮節約了時間和成本。

發明內容

基于現有技術中存在的以上問題，本發明的目的是提供改良的VEGF捕獲劑融合蛋白的純化方法，尤其是一種包括親和層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析三個步驟的純化方法。本發明的純化方法很好的避免在陽離子交換層析中洗脫蛋白過程中發生蛋白聚集。

本發明所述VEGF捕獲劑融合蛋白純化方法，包括以下步驟：

(1)Protein A親和層析

用含鹽的平衡緩沖液對親和層析柱進行平衡，將含有由SEQ ID NO:1編碼的VEGF捕獲劑融合蛋白的細胞培養上清進行上樣，使所述融合蛋白吸附于Protein A親和層析介質上，上樣結束后用所述含鹽的平衡緩沖液進行沖洗，再用不含鹽的緩沖液對蛋白進行洗脫，收集洗脫液。

(2)陰離子交換層析

用含鹽的平衡緩沖液對陰離子交換層析柱進行平衡，將步驟(1)處理后的蛋白液調節至pH8.30-8.50后進行上樣，使融合蛋白吸附于陰離子交換層析介質上，上樣結束后用Tris緩沖液進行沖洗，再用Bis-Tris緩沖液對蛋白進行洗脫，收集洗脫液。