[發(fā)明專利]一種核糖核酸酶抑制劑包涵體的復(fù)性方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711350922.5
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108424441B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李新亮
• 申請（專利權(quán)）人: 上海兆維科技發(fā)展有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/18
• 代理公司: 上海專利商標事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明涉及一種核糖核酸酶抑制劑(RI)包涵體的復(fù)性方法。本發(fā)明的方法在復(fù)性過程中應(yīng)用了RNase A，使RI的復(fù)性得率大大提高，而RNase A很容易在后續(xù)的純化過程中，經(jīng)由一定濃度無機鹽在偏酸性的條件下除去，而RI則可以藉由適當?shù)募兓瘶撕灦Y(jié)合于純化柱上，從而很方便地進行純化，得到高純度的RI。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于化學(xué)及生物工程領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種核糖核酸酶抑制劑包涵體的復(fù)性方法。

背景技術(shù)

核糖核酸酶抑制因子(Ribonuclease Inhibitor，RI)是哺乳動物細胞漿中的一種酸性蛋白質(zhì)，分子量50kD。它能夠以1：1的比例結(jié)合并抑制胰腺核糖核酸酶超家族中的RNase A和血管形成因子(Angiogenin，Ang)。RI與Ang的結(jié)合引起人們的關(guān)注是因為Ang具有促進新生血管內(nèi)皮生長的活性，而新生血管形成是實體腫瘤組織生長所必需的。將RI注射到小鼠的移植腫瘤組織內(nèi)，導(dǎo)致實體腫瘤組織大面積壞死及新生血管明顯減少。根據(jù)RI一級結(jié)構(gòu)的一個重要特點，32個半胱氨酸殘基全部為還原狀態(tài)，認為RI具有抗氧化的作用。這一作用在細胞水平得到證實：能夠過表達RI的C6細胞抗過氧化氫損傷的能力明顯增強。因此，通過基因工程的方法生產(chǎn)具有生物活性的RI無疑具有重要作用。

RI是一種多功能的體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)分子，是核糖核酸酶A(RNase A)的抑制劑，它與RNase A緊密結(jié)合，形成馬蹄形的立體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致核糖核酸酶的活性受到抑制。它參與基因的表達與調(diào)控，是具有重要功能的一種蛋白質(zhì)。在RI的結(jié)構(gòu)中，有11對二硫鍵和8個游離的巰基。巰基是RI的活性必需基團，巰基的氧化會導(dǎo)致RI的失活。作為RNase A的抑制劑，RI在體外實驗中可以保護mRNA及rRNA免受RNase的降解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成旺盛。在生長旺盛的組織如再生肝和妊娠鼠肝中皆可檢測到RI活力增強。在衰老過程中，人體RI活力下降，RNase A活力上升，RNA降解加快，蛋白合成速度下降。即當內(nèi)外環(huán)境改變時，易使含有30個-SH的RI的活性下降甚至失活，導(dǎo)致體內(nèi)主要以RNase A-RI，復(fù)合物形式而存在的RNaseA呈游離狀態(tài)，加速RNA(特別是mRNA，及rRNA)降解，進而影響蛋白質(zhì)的合成速率，引起組織萎縮、功能下降。RI及RNase A的活性與機體的狀態(tài)及年齡有關(guān)，故可作為研究衰老的指標之一。總之，RI通過對RNA和蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)作用而對組織細胞的功能狀態(tài)起調(diào)節(jié)作用。

核糖核酸酶抑制劑(RI)的制備方法主要是直接從人體胎盤提取、大腸桿菌重組可溶性表達、包涵體復(fù)性這三種方法獲得。

直接從人體胎盤提取核糖核酸酶抑制劑(RI)的方法是由美國Promega公司最早發(fā)現(xiàn)并建立的，但是采用該方法所使用的原料人體胎盤近來受到國家的管控，而且人體胎盤也會存在母體病毒污染的風(fēng)險，提取收率偏低，再加上存放的時間、溫度都會對核糖核酸酶抑制劑(RI)產(chǎn)生不確定的影響，無法實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)。

因此，當前多采用基因工程的方法，使用大腸桿菌系統(tǒng)進行制備。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有技術(shù)成熟、目的蛋白表達量高、操作簡單等特點。通過克隆人體胎盤的核糖核酸酶抑制劑的基因序列，構(gòu)建表達載體，在大腸桿菌中進行表達，成為一種全新獲得核糖核酸酶抑制劑(RI)的方式。但是核糖核酸酶抑制劑(RI)序列中含有11對二硫鍵和8個游離的巰基，在進行大腸桿菌誘導(dǎo)表達過程中蛋白結(jié)構(gòu)易于錯誤折疊，表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。

中國專利申請CN102234649A報道可以進行RI的可溶性表達，但是需要在RI序列5’-端加入TrxA硫氧還蛋白融合標簽，純化過程中采用TEV酶切的方式再將標簽去除，該方法存在著TrxA標簽切除不徹底、TEV酶殘留污染等問題。

中國專利申請CN1584031A報道人來源的核糖核酸酶抑制劑(RI)可以經(jīng)原核系統(tǒng)(大腸桿菌)、真核系統(tǒng)(酵母)進行表達，然后菌體破碎、親和層析純化，但并未公開提及其表達的可溶性程度。