[發明專利]一種核糖核酸酶抑制劑包涵體的復性方法

有效

• 申請號: 201711350922.5
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108424441B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 李新亮
• 申請（專利權）人: 上海兆維科技發展有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/18
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種核糖核酸酶抑制因子包涵體的復性方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 對核糖核酸酶抑制因子包涵體進行變性、溶解；

(2) 對(1)的變性產物進行復性；其中，在復性液中添加核酸酶RNase A，所述的核酸酶RNase A在復性液中的終濃度為10-20 mM；所述的復性液包含：Tris-HCl、無機鹽、還原劑；所述Tris-HCl的終濃度為35±15mM，pH為7.5±0.5；所述還原劑為DTT，其終濃度是1±0.5mM；其中，將(1)的變性產物與復性液按照1:(10±5)的體積比例混合；復性時間20±10hr，復性溫度4±1℃；和

(3) 對(2)的復性產物進行柱純化，獲得可溶性核糖核酸酶抑制因子。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)之前，還包括以下步驟：

重組表達核糖核酸酶抑制因子，獲得含有包涵體的表達宿主；

對表達宿主進行破碎，分離出包涵體。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，表達宿主破碎、裂解后，進行離心獲取沉淀，洗滌。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，利用裂解緩沖液裂解，所述的裂解緩沖液包含：Tris-HCl、無機鹽、甘油。

5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，利用洗滌緩沖液洗滌，所述洗滌緩沖液包含：Tris-HCl、無機鹽、表面活性劑。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，利用變性液對包涵體進行變性、溶解，其選自尿素、十二烷基肌氨酸鈉或SDS的變性劑。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的變性劑是尿素，其終濃度是6±2 M。

8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的變性劑是十二烷基肌氨酸鈉，其終濃度是1±0.5%(w/v)。

9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的變性劑是SDS，其終濃度是2±1%(w/v)。

10.如權利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述的核酸酶RNase A在復性液中的終濃度為12～18 mM。

11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，將(2)的復性產物上樣至純化柱，利用洗滌緩沖液洗去與核糖核酸酶抑制因子結合的核酸酶RNase A；然后，利用梯度洗脫緩沖液進行梯度洗脫，得到純化的可溶性核糖核酸酶抑制因子。

12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述的洗滌緩沖液包含：NaAc/HAc、無機鹽、還原劑。

13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的NaAc/HAc的終濃度為35±15mM，pH為5.0±0.5。

14.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的無機鹽的終濃度是300±15mM。

15.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的還原劑的終濃度是1±0.5mM。

16.權利要求11所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脫緩沖液包含Tris-HCl、無機鹽、甘油、還原劑。

17.權利要求16所述的方法，其特征在于，所述的Tris-HCl終濃度為35±15mM，pH為7.5±0.5。

18.權利要求16所述的方法，其特征在于，所述的無機鹽的終濃度是50±15mM。