[發明專利]一種可視化即時檢測病原體核酸的微流控芯片及其制備方法和檢測方法

在審

• 申請號: 201711350711.1
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN107904161A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 李敏;汪驊;劉倩;徐燕萍;秦娟秀
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12M1/00;C12Q1/6806;C12Q1/6844;C12Q1/14;C12R1/46
• 代理公司: 上海申新律師事務所31272
• 代理人: 俞滌炯

技術領域

本發明涉及集成微流控芯片制造技術和基因診斷領域，尤其涉及一種可視化即時檢測病原體核酸的微流控芯片及其制備方法，以及一種采用微流控芯片進行病原體核酸的檢測方法。

背景技術

人類健康和醫學的發展史是一部與各種感染性疾病斗爭的歷史。每一次新發感染性疾病的出現，都導致了嚴重的社會恐慌和經濟損失。呼吸道感染作為兒科的常見病、多發病，是引起世界范圍內5歲以下兒童死亡的首位原因，其臨床表現易被認識，但引起呼吸道感染的病因卻很難明確。

呼吸道病原體的實驗室檢測，可以明確感染病因，有利于對疾病做出及時診斷、治療，制定防控策略，阻止傳播和流行。下呼吸道感染是最常見呼吸道感染性疾病，其中以社區獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)為多見，是威脅人群健康的常見感染性疾病之一。我國每年有數百萬人罹患CAP，近年來，由于社會人口的老齡化、免疫損害宿主增加、病原體變遷和抗生素耐藥率上升等原因，CAP的診治面臨許多新問題。CAP是在院外由細菌，病毒、衣原體和支原體等多種微生物所引起。肺炎鏈球菌和肺炎支原體在CAP的感染率分別為27％，15％。因此，檢測上述高感染率的呼吸道病原體，有助于對CAP做出及時診斷、治療，制定防控策略，阻止傳播和流行。自1850年首次使用海藻(瓊脂)生產培養基方法到分子生物學方法被引入病原體檢測，微生物學檢測法的變化日新月異。目前實驗室檢測方法主要包括病原體分離培養、血清學檢測和分子生物學檢測。肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia，Sp)和肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia，Mp)分離培養雖然高度特異，但其敏感性較低，周期較長。病原體血清學抗體檢測不能解決免疫學檢測的“窗口期”問題，無法判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態。病原體血清抗原檢測雖具有很高的檢測價值，但檢出限為10^5-7個病原體，靈敏度低，限制了其在臨床實驗室的廣泛開展?；诓≡wDNA或RNA的核酸檢測方法具有高敏感性、高特異性等優點，聚合酶鏈反應(PCR)技術已在實驗室診斷中起到了關鍵的作用，已成為目前所有病原體首推的重要的確診手段之一，但是，由于用于臨床實驗室的PCR技術都需依賴特定場所、設備、儀器及經培訓上崗的工作人員，操作復雜，費時，技術要求高不適合病原體檢測的常規開展。因此，臨床微生物實驗室急待研發、轉化和推廣快速、靈敏和準確的鑒定上述病原體核酸的技術方法。目前，FilmArray呼吸道病原體檢測儀作為一種容易操作的多重PCR平臺，可用于多重病原體檢測，但仍需精良儀器對操作過程進行控制，且檢測費用昂貴，限制了其在臨床上的廣泛使用。

環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型的體外等溫擴增特異性核酸片段技術。此技術主要利用兩對特殊設計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，使反應中在模板兩端引物結合處循環出現環狀單鏈結構，從而保證引物可以在等溫條件下順利與模板結合并進行鏈置換擴增反應。因為其克服了傳統PCR反應需通過反復的熱變性過程獲得單鏈模板的缺點，并避免了反復降溫的耗時過程，實現了恒溫條件下的連續快速擴增，可以在15-60分鐘擴增出10⁹-10¹⁰倍靶序列拷貝，具有更高的靈敏度、特異性和擴增效率。LAMP在病原微生物的快速檢測、遺傳病診斷、單核苷酸多態性分型等領域顯示出巨大的應用潛力。目前LAMP已應用于腫瘤突變基因、結核分枝桿菌、及病毒的快速檢測。