[發(fā)明專(zhuān)利]一種可視化即時(shí)檢測(cè)病原體核酸的微流控芯片及其制備方法和檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711350711.1
• 申請(qǐng)日: 2017-12-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107904161A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李敏;汪驊;劉倩;徐燕萍;秦娟秀
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12M1/34
• 分類(lèi)號(hào): C12M1/34;C12M1/00;C12Q1/6806;C12Q1/6844;C12Q1/14;C12R1/46
• 代理公司: 上海申新律師事務(wù)所31272
• 代理人: 俞滌炯

1.一種可視化即時(shí)檢測(cè)病原體核酸的微流控芯片，其特征在于，包括設(shè)有微流控通道的上層基片以及與該上層基片封合的下層基片，所述上層基片設(shè)置依次連通的樣本處理及DNA提取區(qū)、流體控制區(qū)以及可視化檢測(cè)區(qū)；其中，所述可視化檢測(cè)區(qū)包括檢測(cè)池，所述檢測(cè)池設(shè)有包被特異性引物或DNA的色譜紙；所述流體控制區(qū)設(shè)置進(jìn)行流體控制的螺絲閥。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述可視化檢測(cè)區(qū)的流體通道包括第一通道、第二通道、第三通道和第四通道；其中，所述第一通道的一端為連接流體控制區(qū)和反應(yīng)試劑入口，所述第一通道的另一端連接第二通道的中部；所述第二通道的兩端各自連接用于將流體分配至相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)池的第三通道，在所述檢測(cè)池入口處的部分第三通道為波浪形通道；所述第四通道用于連接檢測(cè)池和微池廢液出口。

3.一種如權(quán)利要求1所述的微流控芯片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1)采用光刻膠制作微流控芯片陽(yáng)模；

步驟2)將鑄模溶液澆在步驟1)制得的微流控芯片陽(yáng)模上，待鑄模溶液固化后脫模獲得具有微流控通道結(jié)構(gòu)的上層基片；

步驟3)等離子機(jī)清洗由步驟2)獲得的的上層基片以及下層基片，將包被特異型引物或DNA的色譜紙分別置于各檢測(cè)池，然后將上層基片與下層基片進(jìn)行封合，制備成可檢測(cè)病原體核酸的微流控芯片。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，將螺絲閥預(yù)先包埋于未固化的鑄模溶液中，所述螺絲閥的底部與微流控通道的垂直距離為0.3～0.8mm；在鑄模溶液固化后，將螺絲閥旋轉(zhuǎn)取出，形成具有螺紋的通道，以實(shí)現(xiàn)流體控制。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的制備方法，其特征在于，所述螺絲閥的直徑為3～8mm，高為3～8mm，螺距為0.5～1.0mm。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述光刻膠為AZ-50光刻膠，所述鑄模溶液為PDMS溶液，所述下層基片為玻璃片，所述螺絲閥的材質(zhì)為PMMA。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的的制備方法，其特征在于，所述色譜紙包被的引物包括肺炎支原體等溫?cái)U(kuò)增引物和肺炎鏈球菌等溫?cái)U(kuò)增引物，所述肺炎支原體等溫?cái)U(kuò)增引物的序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示，所述肺炎鏈球菌等溫?cái)U(kuò)增引物的序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：10所示。

8.一種采用權(quán)利要求1所述的微流控芯片用于病原體核酸的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟A)樣本的處理：采集咽拭子樣本，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水中經(jīng)生理鹽稀釋、離心后獲得沉淀物，將所述沉淀物與裂解液和磁珠混勻，獲得混合液；

步驟B)病原體核酸的提取：將步驟A)獲得的混合液從樣品入口處加入到微流控芯片的樣品處理及DNA提取區(qū)，封堵樣品入口及樣品廢液出口，關(guān)閉螺絲閥；微流控芯片置熱板上于一定溫度下加熱一段時(shí)間；開(kāi)啟樣品入口及樣品廢液出口，通過(guò)磁珠法在微流控芯片上提取DNA；

步驟C)病原體核酸的檢測(cè)：將去離子水加入到樣品處理區(qū)后封堵樣品入口及樣品廢液出口，微流控芯片置熱板上于一定溫度下加熱一段時(shí)間，旋開(kāi)螺絲閥；DNA樣本在熱氣壓作用下平均分配至各個(gè)檢測(cè)池，所述檢測(cè)池中設(shè)有包被特異性引物或DNA的色譜紙；關(guān)閉螺絲閥，從反應(yīng)試劑入口加入LAMP反應(yīng)液，然后再加入礦物油，封堵反應(yīng)試劑入口及微池廢液出口；將微流控芯片置于熱板于一定反應(yīng)溫度下加熱一段反應(yīng)時(shí)間，記錄檢測(cè)結(jié)果。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述色譜紙包被的引物包括肺炎支原體等溫?cái)U(kuò)增引物和肺炎鏈球菌等溫?cái)U(kuò)增引物，所述肺炎支原體等溫?cái)U(kuò)增引物的序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示，所述肺炎鏈球菌等溫?cái)U(kuò)增引物的序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：10所示；所述LAMP反應(yīng)液包括肺炎支原體等溫?cái)U(kuò)增引物或肺炎鏈球菌等溫?cái)U(kuò)增引物、反應(yīng)緩沖液(RM)、鈣黃綠素、Bst DNA以及去離子水。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟B)中，通過(guò)磁珠法在微流控芯片上提取DNA的步驟包括：

a)將磁柱置于樣品處理及DNA提取區(qū)的上方，吸附磁珠，移液器除去廢液；

b)移開(kāi)磁柱，移液器吸取無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌磁珠，再將磁柱置于樣品處理及DNA提取區(qū)的上方，移液器除去廢液；

c)移開(kāi)磁柱，移液器吸取75％乙醇反復(fù)洗滌磁珠，再將將磁柱置于樣品處理及DNA提取區(qū)的上方，移液器除去廢液。