[發(fā)明專(zhuān)利]用于人PIK3CA基因突變檢測(cè)的試劑盒及臨床應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711350112.X
• 申請(qǐng)日: 2017-12-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109929930A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬永;丁燕芬;丁娜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明涉及一種人PIK3CA基因突變檢測(cè)的引物、探針及試劑盒。發(fā)明篩選的特異性ARMS引物及探針，及優(yōu)化的反應(yīng)體系，能夠獲得檢測(cè)性能優(yōu)異的用于人PIK3CA基因突變檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒檢測(cè)快速，90分鐘即可完成檢測(cè)；靈敏度高，可以檢測(cè)10ng DNA樣品中含量低至1％的PIK3CA基因突變；特異性高，與野生型樣品無(wú)擴(kuò)增；操作簡(jiǎn)便，成本低廉，有利于規(guī)模化，市場(chǎng)化，能有效應(yīng)用于臨床精準(zhǔn)指導(dǎo)用藥。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種人PIK3CA基因突變檢測(cè)的引物、探針及試劑盒。

背景技術(shù)

磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α(PIK3CA)基因是3號(hào)染色體上長(zhǎng)度為34kb的基因，由20個(gè)外顯子組成，編碼I類(lèi)磷脂酰肌醇-3-激酶的p110α催化亞單位。PIK3CA基因是一種癌基因，是發(fā)生體細(xì)胞突變的唯一基因，PIK3CA基因的突變包括基因的擴(kuò)增、缺失和體細(xì)胞性的錯(cuò)義突變等。PIK3CA基因在多種人類(lèi)腫瘤中存在突變，導(dǎo)致PI3K信號(hào)途徑在不同水平發(fā)生調(diào)控異常，在結(jié)直腸腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤中發(fā)生了高頻體細(xì)胞突變。

PIK3CA基因的突變頻率與K-ras等相比是較低的，但是研究表明PI3K-PTEN-AKT信號(hào)通路在結(jié)直腸細(xì)胞癌變過(guò)程中具有不可忽視的重要性。PIK3CA基因突變檢測(cè)尤其適用于結(jié)直腸癌的診斷預(yù)后與用藥檢測(cè)，在結(jié)直腸癌中點(diǎn)突變率為10％-32％，主要突變熱點(diǎn)集中于外顯子9和外顯子20。PIK3CA基因突變不僅預(yù)示結(jié)直腸癌患者的預(yù)后較差，并且與患者對(duì)西妥昔單抗耐藥性的增強(qiáng)密切相關(guān)。PI3K作為EGFR下游信號(hào)分子被激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI等藥物的耐藥。PIK3CA基因突變檢測(cè)可以預(yù)測(cè)腫瘤患者對(duì)EGFR-TKI等藥物的耐藥性。

現(xiàn)有的基因突變檢測(cè)方法主要有直接測(cè)序、限制性小片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、高分辨率溶解曲線分析(HighResolution Melting Curve Analysis，HRM)等。直接測(cè)序法靈敏度較低，檢測(cè)周期長(zhǎng)，成本高昂，通量不高，而且是非閉管反應(yīng)，難以避免交叉污染。RFLP法存在檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作繁瑣，成本高昂，易污染等不足。HRM法同樣存在操作復(fù)雜，難以避免污染等缺點(diǎn)。

本申請(qǐng)采用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)技術(shù)(Amplification Refractpry MutationSystem，ARMS) 與Taqman探針相結(jié)合的方法檢測(cè)PIK3CA基因突變。擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)又名等位基因特異 PCR，是基于PCR技術(shù)檢測(cè)點(diǎn)突變或多態(tài)性的技術(shù)ARMS引物的3’末端設(shè)計(jì)在突變位點(diǎn)，最后一個(gè)堿基與突變的堿基配對(duì)；采用無(wú)3’-5’外切酶活性的Taq DNA聚合酶，可特異性地識(shí)別引物3’末端，只有引物3’末端完全配對(duì)時(shí)，才能正常擴(kuò)增，當(dāng)引物3’末端發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，不能有效擴(kuò)增。對(duì)于替換突變，在使用ARMS引物時(shí)，由于野生型與突變型只有一個(gè)堿基的差別，當(dāng)野生型模板含量高時(shí)，可能發(fā)生無(wú)效的引物結(jié)合，由此產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。因此，在引物3’端再人為引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，這樣野生型模板即有兩個(gè)錯(cuò)配堿基，可大大提高引物對(duì)突變型模板的特異性；對(duì)突變型模板只有一個(gè)錯(cuò)配堿基，且不在3’末端，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，可篩選與突變模板具有高結(jié)合效率的引物。采用ARMS方法可針對(duì)已知突變?cè)O(shè)計(jì)合適的引物，并選擇性地?cái)U(kuò)增突變基因。