[發明專利]一種檢測氨肽酶N活性的比色方法

有效

• 申請號: 201711348964.5
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108004295B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 苗向陽;吳昀;王寅玨;郁惠珍;朱小立;趙婧
• 申請（專利權）人: 蘇州健雄職業技術學院
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;G01N21/78
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙) 32267
• 代理人: 馬廣旭

本發明公開了一種檢測氨肽酶N活性的比色方法，通過葫蘆[8]脲識別結合多肽探針，以金納米顆粒作為比色信號報告單元進行比色分析，進行氨肽酶N的活性檢測。本發明所述的檢測氨肽酶N活性的比色方法，方法簡單、合理，基于多肽功能化金納米顆粒/CB[8]超分子組裝體，結合氨肽酶N對于多肽探針N?末端中性氨基酸的識別切割活性，成功構建了一種新型的檢測氨肽酶N活性的比色分析方法。實驗結果表明，本發明構建的檢測方法具有良好的靈敏度和可重復性，檢測限可以達到0.096μg/mL。同時，還具有無需大型昂貴儀器和額外標記等優點，因而在臨床分析檢測中具有很高的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物電化學傳感器技術領域，具體地，涉及一種檢測氨肽酶N活性的比色方法。

背景技術

氨肽酶N（AminopeptidaseN），又稱CD13，隸屬于金屬蛋白酶M1家族，其活性具有鋅離子依賴性。氨肽酶N廣泛存在于多種組織、器官和細胞中，它是細胞膜上的II型整合膜蛋白，其通過分子內一段靠近N末端的螺旋跨膜結構域固定于細胞膜上。氨肽酶N擁有廣泛的底物選擇性，它能夠從蛋白質、多肽或酰胺上水解釋放N-末端的中性或堿性氨基酸，如丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸等。在生物體內，氨肽酶N能夠作用于腦啡肽、血管緊張肽、神經激肽和細胞因子等生物活性分子，從而參與免疫調節、細胞生長和血壓調節等諸多重要的生理代謝過程。

癌癥是世界范圍內嚴重威脅人類健康的惡性疾病之一。腫瘤細胞的侵襲和轉移是癌癥的基本生物學特征，也是導致患者復發或死亡的主要原因。盡管腫瘤細胞的轉移是一個涉及到細胞粘連、趨化、血管增生等一系列生理事件的復雜過程，但腫瘤細胞和其周圍的蛋白水解酶的相互作用對腫瘤的惡化起到了很關鍵的作用。最近有研究發現，氨肽酶N和腫瘤的發生發展密切相關。例如，氨肽酶N可以促進細胞外基質的降解，這一方面可以釋放某些加速腫瘤細胞增殖的生長因子，提高腫瘤細胞的生物利用度；另一方面可以為腫瘤微血管的形成提供空間，從而為腫瘤細胞的侵襲轉移奠定有利基礎。

由于氨肽酶N與腫瘤發生發展的這種密切關系，其在腫瘤組織或細胞中的表達和活性也得到了深入的研究。1990年，Mechtersheimer和M?ller最先采用免疫組化的方法對氨肽酶N在間葉性腫瘤組織中的表達程度進行了分級。1999年，Martínez和他的同事用熒光的方法對乳腺癌組織中的氨肽酶N活性作了檢測。通過對比腫瘤細胞和周圍未感染的組織細胞，他們發現氨肽酶N的活性在乳腺癌腫瘤細胞中是明顯提升的。后續一系列的研究證明，氨肽酶N的活性在卵巢癌、肝癌、肺癌等癌癥組織中也存在明顯的上升。更為重要的是，在乳腺癌和甲狀腺癌患者血清中，氨肽酶N的活性也被發現存在異常上調。因此，氨肽酶N的活性可以作為多種癌癥診斷的重要指標。在此背景下，發展高效可靠的生物傳感方法，實現對氨肽酶N活性的靈敏檢測，有望在癌癥診斷過程中發揮重要的作用。

隨著超分子化學的快速發展，一系列人工合成的大環主體分子在構建分子器件、藥物傳輸系統和生物傳感方法中的應用價值引起研究者越來越多的興趣。其中，由八個甘脲分子縮合而成的葫蘆[8]脲（cucurbit[8]uril，CB[8]）因其能夠同時與兩分子客體結合形成三元超分子體系的獨特性質而備受關注。

發明內容

發明目的：借助CB[8]同時識別結合兩分子多肽探針N-末端苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FGGG）序列的特性，并利用金納米顆粒作為比色信號報告單元，我們提供了一種檢測氨肽酶N活性的比色分析方法。并且該方法能夠實現最低0.096μg/mL氨肽酶N的活性檢測，具有良好的應用前景。