[發明專利]同時表達A型、O型和Asia-1型口蹄疫病毒VP1基因重組腺病毒、構建方法及應用

有效

• 申請號: 201711348735.3
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108103034B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 楊玉艾;任紅濤;劉健鵬;鄒權;齊亞輝
• 申請（專利權）人: 云南農業大學動物醫學院;北京生科基因科技有限公司;榆林市動物疫病預防控制中心;墊江縣動物衛生監督所;陜西省動物衛生監督所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/42;A61K39/135;A61P31/14
• 代理公司: 北京智沃律師事務所 11620
• 代理人: 王繼勝

本發明公開了一種同時表達A型、O型和Asia?1型口蹄疫病毒VP1基因重組腺病毒、構建方法及應用，屬于生物技術領域，本發明在腺病毒中插入O型口蹄疫病毒VP1基因、A型口蹄疫病毒VP1基因和Asia?1型口蹄疫病毒VP1基因，將各個啟動因子插入到腺病毒穿梭載體中形成重組腺病毒穿梭載體，將腺病毒穿梭載體酶切線性化轉化到含有腺病毒骨架載體的大腸桿菌感受態細胞中，形成重組腺病毒骨架載體，將重組腺病毒骨架載體線性化后，轉染人胚胎腎細胞中，包裝出重組腺病毒，該重組腺病毒應用于制備防疫或治療口蹄疫的藥物或試劑中。本發明的重組腺病毒一次培養就能達到預防三種血清型口蹄疫的發病，大量節約了人工和成本。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一種同時表達A型、O型和Asia-1 型口蹄疫病毒VP1基因重組腺病毒、構建方法及應用。

背景技術

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起偶蹄動物發生的一種急性、烈性傳染病，鑒于口蹄疫疫情一旦爆發均需花費難以估量的人力和財力損失，采取撲殺感染動物的措施不僅不經濟而且不現實。目前，對易感動物有針對性的接種口蹄疫疫苗是成功預防疫病爆發、控制甚至消滅口蹄疫疫情最有效的方法。隨著現代生物學技術的發展，各國學者對口蹄疫疫苗的研制和開發一直沒有放棄。

傳統的口蹄疫疫苗包括弱毒疫苗和滅活疫苗；弱毒疫苗雖然成本低、免疫原性好和抗體持續時間長，但它卻有無法克服的缺點，病毒對動物的減毒不具有廣泛性，且由于新的亞型不斷出現及毒株致弱效果和致弱時間都不能確定，弱毒疫苗的使用會引起免疫動物毒血癥、長期帶毒、排毒等。世界各國雖已培育出幾十個弱毒疫苗株，但無一個弱毒疫苗株可以滿足所有標準，80年代研究發現，歐洲發生的多次口蹄疫流行中分離的毒株與以前的弱毒疫苗株有密切關系。因為病毒對一種動物的減毒并不能保證對其他動物減毒，且由于新的亞型不斷出現及毒株致弱結果和致弱時間都不能確定，因此，弱毒疫苗株已不能適應口蹄疫防制的需要。目前除亞洲某些地區仍在使用外，已被世界絕大多數國家摒棄。許多國家和地區在口蹄疫的防治中，滅活疫苗是目前口蹄疫疫情防控采用的主要疫苗類別。盡管滅活疫苗在控制疾病的過程中扮演了極其重要的角色，但滅活疫苗也存在諸多缺點，表現為有效抗原含量低、免疫效果較差、免疫期較短，不能有效刺激機體產生細胞免疫應答且只能維持較短的中和抗體水平，免疫動物可能成為病毒攜帶者等等；這就促使人們研究和開發新型口蹄疫疫苗來防控本病。

口蹄疫新型疫苗是利用分子生物學技術基于重組病毒和免疫學基礎上的發展而來，將消除滅活疫苗生產中感染性病毒的潛在散毒危險，有可能不依賴組織培養技術和不需要處理病毒的感染性基因就可以獲得病毒的免疫性成分。近年來，對亞單位疫苗、載體疫苗、基因缺失疫苗合成肽疫苗、核酸疫苗、植物反應器可飼疫苗及多表位疫苗等新型口蹄疫疫苗的研究已成為該領域的熱點。

人5型復制缺陷型腺病毒載體(HAd5)用于疫苗研制有諸多優點。HAd5 載體能穩定表達外源基因，以HAd5為載體制成的疫苗對動物安全，不存在返毒現象；HAd5疫苗免疫原性好，能高效進入細胞核，可快速，持續的誘導體液免疫，細胞免疫和黏膜免疫，對預防經空氣傳播的病毒性傳染病非常重要；HAd5 基因組本身有感染性，不需要被整合到細胞基因組中，病毒轉染細胞后就能包裝成完整的病毒顆粒，基因毒性小；腺病毒感染宿主范圍廣，可將目的基因轉入分裂期及非分裂期細胞；HAd5刪除了E3區，能容納較大的外源基因，可攜帶大于30kb的外源片段進入活體細胞，并且刪除E3區后，解除了疫苗的免疫逃逸功能；腺病毒制備簡單，容易在轉瓶，發酵罐等條件下大規模生產，并能在懸浮細胞內獲得較高的滴度；免疫方便，可選擇方式極多，靜脈注射、肌肉注射、黏膜免疫；HAd5載體疫苗與其他疫苗免疫能增強免疫效果。以上這些均說明了HAd5疫苗安全，免疫效果好，并且免疫方便，易于推廣。

非復制型腺病毒因為其更加的安全有效、以低劑量的方式產生抗原蛋白而不裂解細胞等特點，使表達抗原的時間更加持久，有利于激發機體長期的免疫反應。目前，有許多研究機構均對其進行研究，例如：中國人民解放軍軍事醫學科學院進行了用于狂犬病口服免疫的犬2型腺病毒重組載體的相關技術研究。

發明內容