[發明專利]鰈形目鰨科魚類核糖體內轉錄間隔區1（ITS1）通用引物設計方法及應用

在審

• 申請號: 201711348352.6
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN107881248A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 龔理;孔曉瑜
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙)33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明屬于分子生物技術領域，尤其是涉及鰈形目鰨科魚類核糖體內轉錄間隔區1（ITS1）通用引物設計方法及應用。

背景技術

鰨科(Soleidae)體呈橢圓形，極為側扁，兩眼都位于身體的右側，有些則位于左側方，口小且不對稱，上下頜不發達，有些魚種的吻端下垂，盲側的牙齒較為發達，有細齒帶，腭骨則沒有牙齒，前鰓蓋骨緣外覆蓋有皮膜或鱗片。魚體外被有圓鱗、櫛鱗或皮膜，側線單一，背鰭起始于眼睛的上方，背鰭、臀鰭及尾鰭有些會相連，有些則分離。胸鰭小，或無胸鰭，腹鰭也很小，有些魚的盲側并無腹鰭，有時會與臀鰭相連。鰨科作為鰈形目魚類最豐富的類群(約35屬175種)，很多種類都具有非常重要的經濟價值，但是迄今關于鰨科魚類核糖體序列的報道極其罕見，其中關于其核糖體內轉錄間隔區1的研究更是空白。

發明內容

本發明的目的在于提供鰈形目鰨科魚類核糖體內轉錄間隔區1（ITS1）通用引物設計方法，該方法基于核糖體內轉錄間隔區1(ITS1)兩端保守的18S rDNA和5.8S rDNA序列設計引物序列，所得的引物應用范圍廣，對核糖體內轉錄間隔區1的研究具有重要的意義。

本發明的另一目的在于提供所述設計方法設計的通用引物。該引物用于核糖體內轉錄間隔區1(ITS1)的擴增，速率大，產率高。

本發明的又一目的在于提供所述通用引物在鑒別鰨科魚類中的應用，該鑒定方法準確高效，克服了形態特征鑒定的缺陷，解決了種質混雜的問題。

具體而言，本發明一方面提供了鰈形目鰨科魚類核糖體內轉錄間隔區1（ITS1）通用引物設計方法，具體過程為：

從Genbank獲取鰨科魚類18S rDNA和5.8S rDNA序列，利用ClustalXv1.83做序列的比對，分別在3’端和5’端找出保守序列，作為引物候選區，該方法基于核糖體內轉錄間隔區1(ITS1)兩端保守的18S rDNA和5.8S rDNA序列設計引物序列，極大地擴大了所得引物的應用范圍；

利用OLIGO v6軟件對候選區序列進行分析，引物序列選擇條件：引物長度23-25bp左右，GC含量40％-65％，退火溫度為55-60℃，該條件能夠有效避免多聚嘌呤和多聚嘧啶序列的產生，使堿基在引物中能夠分布均勻。

在本發明的另一方面，還提供所述設計方法設計的通用引物，其正向引物序列為：TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA，反向引物序列為：AAGCGACCCTCAGACAGGCGTAG。將引物用于核糖體內轉錄間隔區1(ITS1)的擴增，速率大，產率高。

在本發明的又一方面，還提供了所述通用引物在鑒別鰨科魚類中的應用，具體過程為：提取待鑒別鰨科魚類的基因組DNA，使用通用引物對提取的DNA進行核糖體內轉錄間隔區1（ITS1）擴增反應，對擴增產物進行純化測序。所擴增的ITS1進化速率相對較快，在種間則表現出顯著的差異，能夠準確高效地鑒別鰨科魚類，克服了形態特征鑒定的缺陷，解決了種質混雜的問題。

作為優選，擴增反應體系為：取100ng模板DNA，0.5μL濃度為10μmol/L的上游引物，0.5μL濃度為10μmol/L的下游引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL濃度為10mmol/L的dNTP，1.5μL濃度為25mmol/L的MgCl₂，0.2μL Taq聚合酶混合，加雙蒸水至25μL。該擴增體系為擴增提供了最優的酸堿度和離子濃度，使聚合酶的活性高，提高了擴增產物的收率。

作為優選，擴增反應條件為：95℃預變性5min，然后95℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，進行30個循環，最后72℃延伸5min。該條件下，靶序列變性徹底，其不影響Taq酶的活性，引物延伸完全，能夠達到有效的擴增量，且非特異性擴增少。

與現有技術相比，本發明的優點在于：本發明所公開的引物設計方法是基于核糖體內轉錄間隔區1(ITS1)兩端保守的18S rDNA和5.8S rDNA序列設計，所得到的引物擴增效率高，擴增的ITS1進化速率相對較快，在種內基本趨于相似，而在種間則表現出顯著的差異；將該引物用于鰨科魚類，準確度高，克服了形態特征鑒定的缺陷，解決了種質混雜的問題。

附圖說明

圖1為擴增產物的電泳條帶，M為DNA Marker，泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9為擴增產物的電泳結果。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖作進一步詳細描述：

實施例1：