[發明專利]鰈形目鰨科魚類核糖體內轉錄間隔區1（ITS1）通用引物設計方法及應用

在審

• 申請號: 201711348352.6
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN107881248A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 龔理;孔曉瑜
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙)33213
• 代理人: 吳秉中

1.鰈形目鰨科魚類核糖體內轉錄間隔區1（ITS1）通用引物設計方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

1)從Genbank獲取鰨科魚類18S rDNA和5.8S rDNA序列，利用ClustalXv1.83做序列的比對，分別在3’端和5’端找出保守序列，作為引物候選區；

2)利用OLIGO v6軟件對候選區序列進行分析，設定引物序列選擇條件。

2.根據權利要求1所述的鰈形目鰨科魚類核糖體內轉錄間隔區1（ITS1）通用引物設計方法，其特征在于：所述步驟2)中引物序列選擇條件為：引物長度23-25bp左右，GC含量40％-65％，退火溫度為55-60℃。

3.權利要求2所述方法設計的通用引物，其特征在于：所述正向引物序列為：TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA，反向引物序列為：AAGCGACCCTCAGACAGGCGTAG。

4.權利要求3所述通用引物在鑒別鰨科魚類中的應用。

5.根據權利要求4所述的通用引物在鑒別鰨科魚類中的應用，其特征在于：所述應用的具體過程為：提取待鑒別鰨科魚類的基因組DNA，使用通用引物對提取的DNA進行核糖體內轉錄間隔區1（ITS1）擴增反應，對擴增產物進行純化測序。

6. 根據權利要求5所述的通用引物在鑒別鰨科魚類中的應用，其特征在于：所述擴增反應體系為：取100ng模板DNA，0.5μL濃度為10μmol/L的上游引物，0.5μL濃度為10μmol/L的下游引物，2.5μL 10×buffer，0.5μL濃度為10mmol/L的dNTP，1.5μL濃度為25mmol/L的MgCl₂，0.2μL Taq聚合酶混合，加雙蒸水至25μL。

7.根據權利要求5所述的通用引物在鑒別鰨科魚類中的應用，其特征在于：所述擴增反應條件為：95℃預變性5min，然后95℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸1min，進行30個循環，最后72℃延伸5min。