[發明專利]同時檢測七種水仙RNA病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201711346493.4
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN107955841B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 沈建國;高芳鑾;陳細紅;廖富榮;何逸鵬
• 申請（專利權）人: 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了同時檢測七種水仙RNA病毒的多重RT?PCR檢測試劑盒及其檢測方法。本發明的試劑盒可專用于同時檢測水仙黃條病毒、水仙退化病毒、水仙潛隱病毒、南芥菜花葉病毒、水仙普通潛隱病毒、水仙花葉病毒和尼潤潛隱病毒，該試劑盒包括多重RT?PCR特異性引物、隨機引物、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反轉錄酶、Taq PCR Mix、陽性及陰性對照品。通過實驗證明：本發明的特異性引物不僅具有特異性好、靈敏度高、高通量和結果準確的優點，而且檢測方法操作簡便，無需克隆、測序和序列比對的步驟，顯著提高了檢測效率，節約了檢測時間和成本，可以有效用于七種水仙RNA病毒的快速、準確鑒定，應用前景廣泛。

技術領域

本發明涉及同時檢測七種水仙RNA病毒的多重RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法，屬于植物檢疫技術領域，適用于進出境口岸檢疫和農業生產上水仙主要RNA病毒的快速檢測。

背景技術

水仙(Narcissus tazetta L.)屬于石蒜科(Amaryllidaceae)水仙屬(Narcissus)多年生草本植物，是世界著名的觀賞球根花卉。水仙作為我國傳統出口名花，同時也是福建省省花，在我國花卉生產中占據著十分重要的地位。病毒病是水仙上的主要病害，引起種球變小、花箭減小、香氣變淡、鱗莖退化和植株矮化等一系列癥狀，造成水仙的產量和品質嚴重下降。目前，國內外已報道可侵染水仙的主要RNA病毒包括水仙黃條病毒(Narcissusyellow stripe virus，NYSV)、水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus，NDV)、水仙潛隱病毒(Narcissus latent virus，NLV)、南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、水仙普通潛隱病毒(Narcissus common latent virus，NCLV)、水仙花葉病毒(Narcissus mosaic virus，NMV)和尼潤潛隱病毒(Nerine latent virus，NeLV)。由于水仙絕大多數以無性方式繁殖，一旦種球帶毒，病毒將在種球內不斷積累，導致種球退化，并通過子代進一步傳播和擴散，成為遠距離和大范圍傳播的重要途徑。

水仙病毒病的防治極其困難，至今尚無完全有效的方法。加強病毒的早期檢測，及時采取防控措施，仍是預防與控制水仙病毒病的重要手段。目前已報道的水仙病毒檢測方法包括生物學測定、電鏡觀察、血清學檢測和分子生物學檢測方法四種，主要是針對單個病毒或2-3個病毒進行檢測，無法對水仙上需要關注的七種主要RNA病毒(水仙黃條病毒、水仙退化病毒、水仙潛隱病毒、南芥菜花葉病毒、水仙普通潛隱病毒、水仙花葉病毒和尼潤潛隱病毒)進行一次性同時檢測。建立用于水仙上七種主要RNA病毒的高通量分子生物學檢測方法，將極大地提高檢測效率，節約檢測成本。關于同時檢測水仙上七種主要RNA病毒水仙黃條病毒、水仙退化病毒、水仙潛隱病毒、南芥菜花葉病毒、水仙普通潛隱病毒、水仙花葉病毒和尼潤潛隱病毒的方法至今尚未見報道，更未見專門的七重RT-PCR檢測試劑盒。

發明內容

本發明要解決的技術問題是如何同時檢測如下七種水仙RNA病毒：水仙黃條病毒、水仙退化病毒、水仙潛隱病毒、南芥菜花葉病毒、水仙普通潛隱病毒、水仙花葉病毒和/或尼潤潛隱病毒。

為了解決上述技術問題，本發明首先提供了用于鑒定七種水仙RNA病毒的成套引物對。

本發明提供的用于鑒定七種水仙RNA病毒的成套引物對由用于鑒定水仙黃條病毒的特異引物對A、用于鑒定水仙退化病毒的特異引物對B、用于鑒定水仙潛隱病毒的特異引物對C、用于鑒定南芥菜花葉病毒的特異引物對D、用于鑒定水仙普通潛隱病毒的特異引物對E、用于鑒定水仙花葉病毒的特異引物對F和用于鑒定尼潤潛隱病毒的特異引物對G組成；

所述特異引物對A由引物NYSV-F和引物NYSV-R組成；

所述特異引物對B由引物NDV-F和引物NDV-R組成；

所述特異引物對C由引物NLV-F和引物NLV-R組成；