[發明專利]一種具有還原響應性的水溶性殼聚糖基聚集誘導發光熒光探針的制備方法

有效

• 申請號: 201711345493.2
• 申請日: 2017-12-15
• 公開（公告）號: CN108117612B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 王征科;方雯;楊玲;胡巧玲;唐本忠
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C08B37/08
• 分類號: C08B37/08;G01N21/64
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 萬尾甜;韓介梅

本發明公開的一種具有還原響應性的水溶性殼聚糖基聚集誘導發光熒光探針的制備方法，主要步驟包括：采用鹽酸/甲醇混合溶劑體系和EDC/NHS催化體系對殼聚糖分子進行改性，從而制得雙硫鍵連接的羧化殼聚糖CS?ss?COOH；將四苯基乙烯(TPE)熒光分子標記到CS?ss?COOH鏈上得到具有聚集誘導發光(AIE)特性的TPE?CS?ss?COOH。本發明制得的熒光探針具有很好的還原響應性和水溶性，且具有聚集誘導發光特性，與傳統熒光探針相比，不僅具有靈敏度高，光穩定性好，高濃度時無淬滅，熒光光譜不漂移等優點，在谷胱甘肽溶液中還可實現熒光強度的進一步增強，成像效果佳，有望應用于腫瘤細胞特異性示蹤、細胞代謝檢測、藥物代謝檢測、環境監測等領域。

技術領域

本發明涉及一種具有還原響應性和聚集誘導發光特性的水溶性殼聚糖基熒光探針(TPE-CS-ss-COOH)的制備方法。

背景技術

熒光探針是以熒光物質作為指示劑，并在一定波長光的激發下使指示劑產生熒光，通過檢測所產生的熒光實現對被檢測物質的定性或者定量分析。當前，熒光探針主要應用于生物、醫學和環境監測等領域。然而傳統的熒光探針面臨著聚集誘導淬滅(ACQ)效應和細胞毒性兩大問題。聚集誘導發光(AIE)熒光分子的發現無疑提供了一種解決上述問題的思路。在生化檢測領域，使用具有AIE特性的熒光探針可實現高靈敏度特異性檢測，且AIE體系對細胞生理學及增殖影響不大。但是，AIE體系多為共軛類帶有疏水芳香核的分子，不溶于生理水環境，且小分子熒光探針容易從細胞滲透、泄露，繼而引起檢測誤差等問題，因此水溶性大分子AIE熒光探針的研發具有重要意義。

殼聚糖(CS)作為一種富含氨基的天然多糖，具有良好的生物相容性和生物活性，無毒且易于生物降解，被廣泛應用于生物醫學領域。然而，由于分子內和分子間的氫鍵作用，殼聚糖不溶于純水和常見有機溶劑，可通過在殼聚糖分子鏈上引入親水性基團(如羧基、季銨鹽等)破壞分子內和分子間氫鍵從而改善其水溶性。

基于腫瘤細胞與正常細胞之間還原型谷胱甘肽(GSH)濃度的顯著性差異，在殼聚糖分子鏈中引入帶有雙硫鍵結構的羧酸基團，可使設計得到的分子具有良好的水溶性和還原響應性，通過聚集誘導發光熒光基團進一步標記可獲得具有還原響應性的水溶性殼聚糖基聚集誘導發光熒光探針。該探針被腫瘤細胞胞吞后，由于胞內高濃度GSH與分子鏈上的雙硫鍵反應，雙硫鍵斷裂脫去羧基降低其水溶性，粒子發生進一步團聚，從而增強其聚集誘導發光強度，實現腫瘤細胞的特異性示蹤，可拓展殼聚糖在生物檢測領域中的應用。因此，制備一種具有還原響應性的水溶性殼聚糖基熒光探針分子具有重要的科學意義和良好的應用前景。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種具有還原響應性的水溶性殼聚糖基聚集誘導發光熒光探針的制備方法。

本發明涉及一種具有還原響應性的水溶性殼聚糖基聚集誘導發光熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

1)稱取一定質量粘均分子量為1萬-100萬、脫乙酰度60％-95％的殼聚糖為溶質，以0.1mol/L的HCl溶液為溶劑，配制獲得殼聚糖濃度為0.01-0.05g/mL的溶液A；

2)以無水甲醇為溶劑，配制濃度為0.01－0.05g/mL的二硫代二丙酸(DTDP)溶液，并使DTDP與溶液A中殼聚糖鏈上的氨基摩爾比為1:1-2:1，加入一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，使DTDP與EDC的摩爾比為1:1.2-1:2，且EDC與NHS的摩爾比為1:1-1:1.5，在0-4℃冰浴條件下于無水甲醇中活化0.5-2h，獲得溶液B；

3)采用恒壓滴液漏斗向溶液B中滴加溶液A，用1mol/L NaOH調節體系pH＝4-5，室溫條件下反應24-48h，旋蒸(通常為50-90℃)除去甲醇得濃縮液，加入體積為濃縮液5-7倍的水，過濾(或離心)除去不溶物，獲得溶液C；