[發(fā)明專利]一種直接PCR鑒定微量基因技術(shù)的改進方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711343537.8
• 申請日: 2017-12-07
• 公開（公告）號: CN109897892A
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 不公告發(fā)明人
• 申請（專利權(quán)）人: 中禾生物種業(yè)集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明改進直接PCR方法，通過在耐熱DNA聚合酶的反應(yīng)體系中加入氯化鈷1mM/L的羥甲基纖維素鈉0.5M/L處理，并在PCR擴增的時候設(shè)計內(nèi)外兩重引物來進行擴增目標(biāo)序列，并摸索了合適的擴增條件作為參考。這使得即使只有微量微克級別的粗組份基因組DNA，也能夠得到有效的直接擴增。免去了微量DNA的提取過程，提高了工作效率，相比于傳統(tǒng)直接PCR方法，本方法使得微量粗組份基因組DNA擴增效率大為提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本實驗發(fā)明專利涉及一種直接PCR的技術(shù)，特別是利用有關(guān)粗組分微量基因組的進行直接PCR技術(shù)。

背景技術(shù)

目前，PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展為各種鑒定技術(shù)的主流，PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展出了多樣性，在各行各業(yè)，各種運用過程中發(fā)揮了越來越重要的作用。在作物種質(zhì)資源鑒定的過程中，依靠傳統(tǒng)的生物化學(xué)和遺傳方法，已經(jīng)很難滿足人們進行品種鑒定的需求。利用PCR技術(shù)可以做各種種質(zhì)資源鑒定工作，在現(xiàn)代分子育種工作中，已經(jīng)發(fā)揮了越來越重要的作用。

在各種鑒定的方法過程中，微量樣品的鑒定引起的大眾的廣泛關(guān)注。一般來講，野外采集的樣品不像其它的樣品。自于野外的種植樣本，比較容易受到各種環(huán)境下的污染。但在各種情況下，野外作業(yè)采集得到的樣品往往處在復(fù)雜的環(huán)境之下，面臨各種環(huán)境污染的風(fēng)險。在野外采集到的樣品，也會因為各種復(fù)雜情況，運輸過程中導(dǎo)致的遺失等等保存處理不當(dāng)?shù)脑蚨l(fā)生樣品大缺失，導(dǎo)致常規(guī)的普通PCR方法很難檢測出來樣品。這種情況下的樣品含量極為低微，為痕跡樣品，混有各種雜質(zhì)的樣品，怎么樣能夠得到有效的檢測一直是個問題。

在某種程度上，在微量樣品的PCR鑒定的過程中，如何提高特異性，并且如何在特異性提高的基礎(chǔ)上還要降低鑒定的非特異性，引起大家的關(guān)注。

本實驗室開發(fā)出來了一種新的方法，該方法僅僅需要設(shè)計所需要的引物。然后通過特殊的PCR條件，就可以進行有效的微克級別樣本基因的直接PCR遺傳鑒定。這種新的設(shè)計與檢測方法，對于痕量品種的樣品處理和資源鑒定，都能起到重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決在微量粗組分中進行直接PCR擴增的問題。而本發(fā)明所加入的物質(zhì)和實驗過程增大了微量粗組分基因組DNA的擴增效率。

附圖說明

圖1為1-4新直接PCR方法(1-2為內(nèi)參，3-4為目的靶向基因)，5-8原直接PCR方法(5-6為內(nèi)參，7-8為目的靶向基因)。根據(jù)新的DNA直接PCR的方法和通過傳統(tǒng)的直接PCR方法與提DNA后PCR的方法進行了對比。我們的結(jié)果顯示：比對傳統(tǒng)的方法，改進了的直接PCR方法，能夠更有效的擴增含有粗組分的微量玉米基因組DNA。這個結(jié)果如圖，無論是在內(nèi)參基因擴增和目的基因擴增，都能得到顯著改善。可見，新直接PCR方法比原直接PCR方法，能夠獲得更亮更多的目的片段，擴增效果要好得多。

具體實施方式

1 假設(shè)以玉米微量樣品DNA的處理為例。玉米10μg微量DNA自然也來自玉米之中，數(shù)量較少且混有較多雜質(zhì)。將玉米樣品首先經(jīng)過用裂解液裂解2分鐘，同步加入蛋白酶K消化2分鐘。裂解液的配方為50mM/L Tris，pH8，25mM/L EDTA，3％SDS，12％PVP。根據(jù)我們的分析，在裂解液中加入含有氯化鈷1mM/L的羥甲基纖維素鈉0.5M/L處理2min，能夠格外增強DNA的溶液分配效率，提高DNA聚合酶在粗質(zhì)材料中聚合的作用。