[發明專利]用于qPCR精確定量Illumina平臺二代測序樣本的定量標準品及其復制方法

在審

• 申請號: 201711343444.5
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN108103174A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 李同恩;羅璽;師鴻翔;周茜;陳田甜;方亞慧;劉春柳;鄭康;張振宇;趙鵬;王秉孝;朱兵
• 申請（專利權）人: 中源協和基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/686;C12Q1/6806
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

本發明公開了一種用于qPCR精確定量Illumina平臺二代測序樣本的定量標準品及其復制方法，包括以下步驟：(1)以商品化試劑盒中的標準品為模板，利用P1、P2接頭引物，進行PCR擴增，接頭引物P1、P2的核苷酸序列為：P1：5'?AATGATACGGCGACCACCGAGA?3'P2：5'?CAAGCAGAAGACGGCATACGAG?3'；(2)反應完成后用AMPure XP bead純化，純化完成后，進行Qubit定量，Qubit測定濃度后，10倍逐級初步稀釋，稀釋后的樣品進行定量實驗，挑選出與商品化標準品濃度最為接近的樣品，作為復制的標準品1，復制的標準品得到后，用無酶水進行10倍逐級稀釋，得到復制的標準品第2?6個；(3)復制的標準品保存于包含緩沖體系和穩定劑的溶液中，本發明的定量準確，使用方便，相對于商品化試劑盒，大大降低了實驗的成本。

技術領域

本發明涉及二代測序(NGS)，具體的說是一種用于qPCR精確定量Illumina平臺二代測序樣本的定量標準品及其復制方法。

背景技術

隨著科技的進步，生物技術行業也在不斷的發展與革新，現有科學研究與醫學應用的要求越來越高，原本的Sanger一代測序技術已經不能滿足其需求。而第二代測序技術(NGS)因其費用低、速度快、通量高等特點，對于基因組測序有著更大的優勢。為了能獲取高質量的核酸測序數據，我們需要對測序文庫的質量進行分析和評價，這一點尤為重要。因此需要在測序前對DNA測序文庫進行精準的定量檢測分析，力求能更加準確地預測簇密度，從而對樣本的上樣量和上樣比例進行合理的安排。這也說明精準定量文庫對于二代測序的結果至關重要，如果文庫的大小預估過低，會導致clusters或多重模板太多，影響數據質量；文庫的大小預估過高，容易使數據的讀取量減少，基因組的覆蓋率降低，因此，低估或高估文庫的量都會對測序的質量與效果產生影響。

NGS流程涉及多種文庫定量方法，常見的有qPCR定量法、分光光度計、熒光染料法或凝膠電泳等。其中，因qPCR定量法檢測靈敏度最高，且非常適合對低濃度的文庫進行檢測，成為DNA文庫定量的金標準，也是唯一一種可以對分子數目進行準確檢測的方法。從理論上來說，使用文庫定量試劑盒檢測出的濃度應與采用分光光度計法定量的濃度接近或比其低，因為qPCR定量法只測定可擴增文庫的分子(雙端接頭完整)，避免了非特異性的檢測，故測定值與真實值最為接近。

標準品是保證qPCR檢測準確性最為重要的一個因素，定量結果的準確性在很大程度上依賴于標準品的準確性，定量標準品的微小變化，都會對定量的結果造成直接的影響。而對于標準品的穩定性及凍存復蘇對其的影響，國內外均鮮有報道。在反復凍融的過程中，固液狀態轉化時發生的體積變化會對酶產生力學剪切作用，酶的結構完整性遭到破壞，進而影響其穩定性，最終影響qPCR定量的準確性。臨床檢測涉及的熒光定量PCR試劑盒，在使用過程中都會存在反復凍融的情況，實驗人員常常擔心因此影響定量結果。

目前qPCR是DNA文庫定量的金標準，也是唯一能夠檢測出有效分子數目的方法。不論使用何種方式建庫，只要文庫末端包含Illumina P5P7芯片結合序列，長度不超過1kb且濃度不低于0.0002pM，都可以使用本方法進行精確定量，對樣本的上樣量和多樣品混樣比例提供合理安排與指導，力求能準確地預測簇密度，獲取高數據量的測序read。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種用于qPCR精確定量Illumina平臺二代測序樣本的定量標準品及其復制方法，節約實驗成本，在反復凍融加速破壞的情況下受到更小的影響，更易儲存，保證更精準的實驗結果。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種用于qPCR精確定量Illumina平臺二代測序樣本的定量標準品的復制方法，包括以下步驟：

(1)以商品化試劑盒中的標準品為模板，利用P1、P2接頭引物，進行PCR擴增，接頭引物P1、P2的核苷酸序列為：

P1：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'SEQ ID NO:1