[發明專利]一種用于檢測膠基型嚼煙對細胞脂質氧化影響的方法

在審

• 申請號: 201711342675.4
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN108120801A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 管瑩;高茜;李雪梅;夭建華;米其利;朱洲海;徐玉瓊;唐萍;陸舍銘
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: G01N33/00
• 分類號: G01N33/00;G01N33/50;G01N33/535;G01N33/569
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生;于洪

本發明涉及一種用于檢測膠基型嚼煙對細胞脂質氧化影響的方法，屬于煙草及煙草制品生物學效應評價技術領域。該方法包括樣品前處理、單細胞懸液的制備、單細胞懸浮液的細胞濃度計算、受試物暴露、收集細胞、樣品制備、標準品稀釋、樣品測定和MDA含量計算十大步驟。本發明綜合考察膠基型嚼煙細的溶出方式、暴露途徑、作用方式，建立了膠基型嚼煙樣品前處理方法，樣品的有效處理、檢測劑量的優化設定以及靶細胞的正確選擇，使得本方法能夠準確有效的檢測膠基型嚼煙對細胞脂質氧化的影響。

技術領域

本發明煙草及煙草制品生物學效應評價技術領域，具體涉及一種用于檢測膠基型嚼煙對細胞脂質氧化影響的方法。

背景技術

隨著人們對健康的關注越來越高，對煙草產品提出了更高的要求，不但要有較好的口感，而且要盡可能的減少人體的不良感受。口含煙制品避免了傳統卷煙制品燃燒所產生的復雜混合物所帶來的危害，現階段已成為國外煙草公司從傳統卷煙制品轉向的新方向之一。根據產品的組分及形態特點，口含煙制品分為傳統含煙葉原料的Snus型口含煙和不含煙葉原料的新型口含煙（如膠基型嚼煙）。口含煙研發人員在產品配方設計初期將不同組份按照不同比例組合調配，形成具有不同風格的初選配方，再結合化學評價和感官評價對配方進行不斷篩選調整形成最終的產品配方。然而初選配方數量眾多，全部進行感官評價耗時耗力，且感官評價側重于對產品的風格口感進行篩選，如何利用生物學測試指標對產品初選配方進篩選，以獲得降低人體不良感受的產品配方，目前尚屬探索階段，無統一的標準方法。

機體在遭受各種不利刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygenspecies, ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species, RNS)產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。這種現象被稱為氧化性損傷，氧化性損傷是一種廣譜性損傷機制，丙二醛（MAD）是脂質氧化的一種重要效應生物標志物，對其進行測定，可用于產品初選配方的進一步篩選，以獲得降低人體不良感受的產品配方。

膠基型嚼煙是一種以煙草或煙草提取物為有效組分，以可食用膠基為載體，通過咀嚼方式向人體遞送煙堿的新型煙草制品。咀嚼過程中煙草或煙草提取物及其他食品添加劑緩慢釋放到唾液中，其釋放方式有別于傳統卷煙和含煙葉原料的Snus型口含煙，因此，有必要針對膠基型口含自身特點建立適合膠基型嚼煙的脂質氧化評價方法。

發明內容

本發明的目的正是針對上述技術問題，對膠基型嚼煙對細胞脂質氧化影響進行了綜合研究，確定了膠基型嚼煙的檢測劑量，以及口含煙制品前處理方法，制定了一種適用于檢測膠基型嚼煙對細胞脂質氧化影響的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種用于檢測膠基型嚼煙對細胞脂質氧化影響的方法，包括如下步驟：

步驟（1），樣品前處理：將膠基型嚼煙制品加入到37℃的口腔角質細胞培養基中，膠基型嚼煙制品的質量與口腔角質細胞培養基的體積比為1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后過濾，向濾液中加入血清，使得血清的最終體積百分濃度為10%，得到待測液；

步驟（2），單細胞懸液的制備：將人口腔角質細胞HOK于37℃、5%CO₂培養箱中采用口腔角質細胞培養基培養，待細胞匯合率為80～90%時移除培養基，用pH值為7.2的磷酸緩沖液洗兩次，棄洗液；加入濃度為0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液進行單層孵育1～2min，每25cm²生長面積的細胞需要加入濃度為0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，單層孵育后再加入口腔角質細胞培養基將細胞懸起，得到單細胞懸浮液；

步驟（3），單細胞懸浮液的細胞濃度計算：用血球計數板計數法對步驟（2）所得單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升單細胞懸浮液的活細胞數；