[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)膠基型嚼煙對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)氧化影響的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711342675.4
• 申請(qǐng)日: 2017-12-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108120801A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 管瑩;高茜;李雪梅;夭建華;米其利;朱洲海;徐玉瓊;唐萍;陸舍銘
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): G01N33/00
• 分類號(hào): G01N33/00;G01N33/50;G01N33/535;G01N33/569
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生;于洪

1.一種用于檢測(cè)膠基型嚼煙對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)氧化影響的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1），樣品前處理：將膠基型嚼煙制品加入到37℃的口腔角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中，膠基型嚼煙制品的質(zhì)量與口腔角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基的體積比為1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后過(guò)濾，向?yàn)V液中加入血清，使得血清的最終體積百分濃度為10%，得到待測(cè)液；

步驟（2），單細(xì)胞懸液的制備：將人口腔角質(zhì)細(xì)胞HOK于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中采用口腔角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率為80～90%時(shí)移除培養(yǎng)基，用pH值為7.2的磷酸緩沖液洗兩次，棄洗液；加入濃度為0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液進(jìn)行單層孵育1～2min，每25cm²生長(zhǎng)面積的細(xì)胞需要加入濃度為0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，單層孵育后再加入口腔角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞懸起，得到單細(xì)胞懸浮液；

步驟（3），單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度計(jì)算：用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法對(duì)步驟（2）所得單細(xì)胞懸浮液的細(xì)胞濃度進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算出每毫升單細(xì)胞懸浮液的活細(xì)胞數(shù)；

步驟（4），細(xì)胞接種：將步驟（3）計(jì)數(shù)后的單細(xì)胞懸浮液用口腔角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至2.0×10⁵個(gè)/mL，再按接種量為4mL/皿接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，之后將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h；

步驟（5），受試物暴露：受試物分為兩組：細(xì)胞對(duì)照組和樣品測(cè)試組；移除步驟（4）中細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)基，再按上述方法進(jìn)行分組；在細(xì)胞對(duì)照組相應(yīng)的皿內(nèi)加入口腔角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基；在樣品測(cè)試組相應(yīng)的皿內(nèi)加入口腔角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基和步驟（1）所得待測(cè)液，至待測(cè)液的體積百分濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%；細(xì)胞對(duì)照組和樣品測(cè)試組的終體積為6mL/皿；之后置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育24h；

步驟（6），收集細(xì)胞：每皿分別收集細(xì)胞，具體的收集方式為：去除培養(yǎng)基，加入PBS4mL，浸泡30s后去除PBS，加入1mL 0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液?jiǎn)螌臃跤?～2min，用口腔角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基懸起，4℃離心，棄上清液，收集細(xì)胞；

步驟（7），樣品制備：將步驟（6）每皿收集得到的細(xì)胞，加入100μl細(xì)胞裂解液在冰浴環(huán)境下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，裂解后，4℃離心，取上清液；

步驟（8），標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：取丙二醛的標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋至1、2、5、10、20、50μM，得到標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液；

步驟（9），樣品測(cè)定：將步驟（7）每皿得到的上清液和步驟（8）不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液分別取0.1mL置于不同的離心管中，隨后向各離心管中分別加入0.2mL 濃度為0.185mg/ml的硫代巴比妥酸MDA檢測(cè)工作液混勻，混勻后于100℃沸水中加熱15min，之后室溫離心，取200μl上清，酶標(biāo)儀540nm測(cè)定吸光度；

步驟（10），MDA含量計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度及吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測(cè)試組吸光度值、細(xì)胞對(duì)照組的吸光度值，計(jì)算樣品測(cè)試組和細(xì)胞對(duì)照組的MDA含量；

之后，將樣品測(cè)試組的MDA含量與細(xì)胞對(duì)照組的MDA含量相比，如有顯著差異，且樣品測(cè)試組的劑量與樣品測(cè)試組的MDA含量之間有劑量反應(yīng)關(guān)系的，即為陽(yáng)性結(jié)果，該膠基型嚼煙會(huì)引起細(xì)胞脂質(zhì)氧化；

將樣品測(cè)試組的MDA含量與細(xì)胞對(duì)照組的MDA含量相比，如無(wú)顯著差異，且樣品測(cè)試組的劑量與樣品測(cè)試組的MDA含量之間無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系的，則為陰性結(jié)果，該膠基型嚼煙不會(huì)引起細(xì)胞脂質(zhì)氧化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)膠基型嚼煙對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)氧化影響的方法，其特征在于，步驟（1）所述的研磨方式具體為：研磨棒順時(shí)針研磨1min后逆時(shí)針研磨1min，交替進(jìn)行，研磨速度為30rpm/min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)膠基型嚼煙對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)氧化影響的方法，其特征在于，步驟（1）所述的過(guò)濾方法為先用定性濾紙進(jìn)行初濾，再用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)膠基型嚼煙對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)氧化影響的方法，其特征在于，步驟（4）所述的細(xì)胞培養(yǎng)皿為60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。