[發(fā)明專利]氨解方法及氨解組合物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711342322.4
• 申請(qǐng)日: 2017-12-14
• 公開（公告）號(hào): CN109956987B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王建鵬;賀玉卓;范玉峰;趙禹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京金斯瑞生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07H21/00
• 分類號(hào): C07H21/00
• 代理公司: 北京華睿卓成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11436
• 代理人: 程淼

本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于在DNA固相合成后進(jìn)行氨解的方法，包括以下步驟：1)向包括用于合成DNA片段的固相載體的合成柱內(nèi)加入氨解組合物；2)將所述合成柱置于裝有氨解緩沖液的可密封容器內(nèi)，并保持所述合成柱位于所述氨解緩沖液的液面上方；以及3)以微波處理所述可密封容器，使得所述固相載體處于所述氨解緩沖液的蒸汽氣氛中；4)取出所述合成柱，以洗脫液處理所述固相載體并收集流出液。本發(fā)明還提供了用于氨解的氨解組合物。本發(fā)明提供的氨解方法僅需使用較少量的氨解試劑，可避免交叉污染，縮短了反應(yīng)時(shí)間，方便清洗溶劑清洗，并且無(wú)需高壓設(shè)備，有利于工業(yè)化和自動(dòng)化使用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其是與DNA固相合成相關(guān)的氨解方法。本發(fā)明還涉及用于氨解的氨解組合物。

背景技術(shù)

DNA合成(尤其是DNA引物合成)是大多是基于固相合成技術(shù)，通過(guò)脫保護(hù)、縮合、氧化以及蓋帽四個(gè)步驟的循環(huán)，將亞磷酰胺單體按3’端到5’端的順序逐個(gè)連接至控制孔徑玻璃球(CPG)表面。每個(gè)亞磷酰胺單體的5’端羥基由二甲氧基三苯基(DMT)基團(tuán)保護(hù)，其堿基上的活性氨基分別由乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、二氮甲基甲脒基(dmf)等基團(tuán)保護(hù)。其中DMT基團(tuán)為酸不穩(wěn)定的，可在3％三氯乙酸的二氯甲烷等溶液中被切除，Ac、Bz、dmf等基團(tuán)為堿不穩(wěn)定基團(tuán)，可在飽和氨水等溶液中被切除。

合成的具體步驟為：

a)使用三氯乙酸溶液將CPG表面的DMT基團(tuán)切除，露出自由羥基；

b)以四氮唑?yàn)榛罨瘎箒喠柞０穯误w活化的3’端磷酸基團(tuán)與CPG表面的亞磷酰胺單體的5’端羥基縮合，形成磷酸二酯鍵；

c)使用碘溶液作為氧化劑，將引物骨架中不穩(wěn)定的三價(jià)磷氧化成穩(wěn)定的五價(jià)磷；

d)使用乙酸酐與氮甲基咪唑作為蓋帽試劑，將步驟b)中未參與反應(yīng)的自由羥基乙酰化；

e)重復(fù)以上a)至d)步驟直至序列合成結(jié)束，并脫去最后一個(gè)DMT基團(tuán)。

待合成結(jié)束后，將CPG粉末浸泡在飽和氨水溶液中并放置在55℃進(jìn)行氨解反應(yīng)。該過(guò)程主要包含三步反應(yīng)：i)將引物從CPG上切除；ii)將各堿基上的氨基保護(hù)基團(tuán)切除；iii)將3’端的磷酸基團(tuán)切除。在合成時(shí)，若3’端需進(jìn)行磷酸化修飾，可以通過(guò)選擇不同類型的CPG而對(duì)iii)步驟進(jìn)行選擇性省略。

使用飽和氨水進(jìn)行氨解時(shí)，通常需要在55℃反應(yīng)16小時(shí)，或在65℃反應(yīng)8小時(shí)。使用飽和氨水與甲胺水溶液的1:1混合液(AMA)作為氨解試劑，可以將反應(yīng)時(shí)間可以縮短至15分鐘左右。但由于上述氨解方式需將CPG粉末浸沒(méi)在氨解溶液中而容易引起交叉污染，且在氨解之后需要花2小時(shí)左右將溶液抽干，故在引物的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中存在一定困難。

現(xiàn)有的微波氨解方式可將氨解反應(yīng)時(shí)間降低至1小時(shí)左右。該微波氨解方式需將CPG粉末浸泡于氫氧化鈉的水和甲醇混合液中，在微波條件下進(jìn)行反應(yīng)。由于溫度升高可能導(dǎo)致溶液爆沸，故需要每隔6-10秒便將反應(yīng)管取出置于冰水中冷卻1-2秒，待反應(yīng)結(jié)束后再將溶液抽干得到最終的產(chǎn)物。該方法存在以下缺點(diǎn)：I)氨解試劑在過(guò)程中容易揮發(fā)而造成可重復(fù)性較差；II)反復(fù)冷卻，操作過(guò)于繁瑣，整體耗時(shí)較長(zhǎng)；III)反應(yīng)結(jié)束后引物無(wú)法進(jìn)行清洗，且抽干水和甲醇混合液耗時(shí)較長(zhǎng)；IV)當(dāng)使用96孔板或384孔板進(jìn)行大規(guī)模引物合成時(shí)，兼容性較差，容易產(chǎn)生交叉污染。

即使二代引物合成柱使用CPG與基質(zhì)制成的熔塊(即CPG Frits)代替CPG粉末作為固相載體，通過(guò)提升合成過(guò)程中的試劑滲透性而提升了引物合成質(zhì)量，但該類合成柱中的固相載體在氨解時(shí)較難取出而浸沒(méi)于氨解試劑中，也降低了微波氨解的工業(yè)化可行性。

使用氣相氨解的方式可顯著降低交叉污染的可能。該氨解方式需將引物合成柱放置在高壓容器中，使用氣體氨氣為氨解試劑，在高壓(約140psi)下反應(yīng)30分鐘左右。雖然該方法后處理環(huán)節(jié)較為簡(jiǎn)單，但是該氨解方式對(duì)于設(shè)備的需求較高。

發(fā)明內(nèi)容