[發(fā)明專利]一種快速檢測肉雞盲腸蛋白質(zhì)水解細菌的方法

有效

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• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN108204962B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏云;孔云虹;瞿越云;趙亞南;念馨;張旭祥;段芳
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/28;G01N1/30;G01N1/38
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;亢能

1.一種快速檢測肉雞盲腸蛋白質(zhì)水解細菌的方法，用于提供給飼養(yǎng)人員肉雞盲腸蛋白質(zhì)水解細菌的信息和數(shù)據(jù)，以確定飼料配方，其特征在于：包括如下步驟：

步驟（1）、樣品采集：試驗分別進行至9 d、16 d、30 d、42 d，在各重復(fù)中隨機抽取試驗雞，屠宰后用無菌的手術(shù)剪剖開雞腹截取盲腸，將經(jīng)預(yù)熱的0.9%Nacl溶液倒在無菌燒杯中，將雞盲腸用無菌鑷子夾住，在0.9%Nacl溶液中輕輕涮洗2-3次，將附著在腸壁上的血漬清洗干凈；將清洗干凈的盲腸放在滅菌錫紙上，用無菌手術(shù)剪剪開腸壁，用無菌的藥勺刮取食糜樣品并存于小燒杯中；

步驟（2）、稀釋樣品：稱取大約10 g 步驟（1）的食糜樣品，裝入無菌過濾袋中，加入經(jīng)預(yù)熱的1×PBS緩沖液，混勻；

步驟（3）、洗脫細胞：將步驟（2）混勻的液體轉(zhuǎn)入到BioRad 勻漿袋中，在BioRad勻漿器高速檔勻漿，通過勻漿袋側(cè)邊的過濾格過濾；

步驟（4）、收集濾液：勻漿過程完成后，用無菌的單層紗布過濾食糜樣品，濾液收集在無菌離心管中，離心；

步驟（5）、收集沉淀物：去除上清液，并將沉淀物重新懸浮于1×PBS緩沖液中，得到細胞懸浮液，待用；

步驟（6）、肉雞盲腸蛋白質(zhì)水解細菌的標定

取上述細胞懸浮液轉(zhuǎn)入到血清瓶中，加1×Tris-HCl緩沖液，再加入BODIPY 標記的綠色熒光小牛血清白蛋白BSA，隨后加入電子傳遞鏈抑制劑，蓋子蓋好，并迅速用鋁箔包嚴避光；將包裹好的血清瓶固定在旋轉(zhuǎn)搖床上室溫搖動一段時間；將血清瓶轉(zhuǎn)移到暗室，打開血清瓶，吸取混合液涂布于用明膠涂層的載玻片上，避光風干；將上述風干的載玻片置于熒光顯微鏡載物臺上100×的物鏡下，通過綠色熒光激發(fā)塊觀察，蛋白質(zhì)水解細菌呈現(xiàn)綠色熒光，記錄每一個蛋白質(zhì)水解細菌的位置；

步驟（7）、肉雞盲腸蛋白質(zhì)水解細菌的回位鑒定

清洗、干燥載玻片，采用寡聚核苷酸探針，使用FISH，在原位條件下回位鑒定肉雞盲腸蛋白質(zhì)水解細菌，其中，寡聚核苷酸探針的5’末端采用Cy3染料標記，得到蛋白質(zhì)水解細菌的位置；

觀察和拍照，根據(jù)記錄的蛋白質(zhì)水解細菌的位置回位到同一個視野下，通過Cy3激發(fā)快觀察FISH染色圖像，通過紅色熒光激發(fā)塊觀察所有FISH染亮的細菌，被綠色熒光蛋白質(zhì)染亮的細菌同時又被寡聚核苷酸探針染亮說明上述寡聚核苷酸探針為靶標的細菌在肉雞盲腸中具有水解蛋白質(zhì)的功能；

步驟（8）、肉雞盲腸蛋白質(zhì)水解細菌的回位定量

清洗、干燥載玻片，用取一定量的DAPI的染液覆蓋于風干的載玻片上中央，將載玻片上的DAPI 染液均勻涂開，并置于黑暗的無菌操作箱中染色20-30min，將染液倒去，并用蒸餾水沖洗2-3遍，避光并在無菌操作箱中風干，即可在顯微鏡下鏡檢；

將干燥好的載玻片置于熒光顯微鏡物鏡臺上100×的物鏡下進行觀察和拍照，根據(jù)上面步驟記錄的蛋白質(zhì)水解細菌的位置回到同一個視野下，通過DAPI激發(fā)快觀察DAPI染色圖像，通過蘭色熒光激發(fā)塊觀察所有細菌；

步驟（9）、盲腸蛋白質(zhì)水解細菌的豐度的確定及統(tǒng)計分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測肉雞盲腸蛋白質(zhì)水解細菌的方法，其特征在于：步驟（1）之前還包括試驗雞的飼養(yǎng)，其中，飼養(yǎng)期包括前期和后期，飼養(yǎng)前期飼料配方如下：

飼料配方包括：玉米 55-60%、玉米豆粕 25-30%、玉米蛋白粉 4-6% 、魚粉 2-4%、大豆油 1-3% 、磷酸氫鈣 1-2% 、細石粉 1-2% 、食鹽 0.1-0.5% 、蛋氨酸 0.1-0.2% 、賴氨酸0.1-0.2%、預(yù)混料為0.8-1%；飼料營養(yǎng)水平如下：

CP 20-25%、Ca 1-1.5%、P 0.5-1%、AP 0.3-0.5%、NaCl 0.3-0.5%、Lys 1-1.5%、Met0.3-0.5%、Thr 0.5-1%、Trp 0.2-0.4%、Arg 1-1.1%、ME 3000-3100，單位為KC/kg；

飼料還包括益生元，益生元為菊粉10-40g/Kg和/或溶菌酶40-200mg/Kg。