[發(fā)明專利]一種適體和魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜及其制備方法和應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201711340992.2 | 申請日： | 2017-12-14 |
| 公開（公告）號： | CN108148810B | 公開（公告）日： | 2020-06-12 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 郭英姝;尚鑫鑫;劉斐;張書圣 | 申請（專利權(quán)）人： | 臨沂大學 |
| 主分類號： | C12N5/09 | 分類號： | C12N5/09;G01N21/76;G01N27/327 |
| 代理公司： | 北京高沃律師事務(wù)所 11569 | 代理人： | 劉奇 |
| 地址： | 276000 山東*** | 國省代碼： | 山東;37 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 魯米諾 納米 粒子 功能 rna 及其 制備 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種適體和魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜，其特征在于，包括RNA膜和功能修飾單元，所述功能修飾單元包括Ramos適體和魯米諾-金納米粒子，所述RNA膜和Ramos適體通過羧基-氨基結(jié)合，所述RNA膜和魯米諾-金納米粒子通過Au-N鍵作用力結(jié)合；所述適體和魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜的制備方法包括以下步驟：
1)將HAuCl4溶液在加熱、攪拌的條件下與魯米諾溶液混合，得到魯米諾-金納米粒子溶液；
2)將5μM磷酸化的DNA1和5μM的引物1于水中混合，95℃保持2min，冷卻至25℃，加入T4連接酶和連接反應(yīng)緩沖液，25℃連接反應(yīng)12h，得到環(huán)化的DNA1；所述DNA1的序列如SEQ IDNO.1所示；所述引物1的序列如SEQ ID NO.4所示，或所述引物1為在SEQ ID NO.4所示的序列的5’端標記有巰基或生物素的物質(zhì)；
3)將5μM磷酸化的DNA2和5μM的引物1于水中混合，95℃保持2min，冷卻至25℃，加入T4連接酶和連接反應(yīng)緩沖液，25℃連接反應(yīng)12h，得到環(huán)化的DNA2；所述DNA2的序列如SEQ IDNO.2所示；
4)將5μM步驟2)得到的所述環(huán)化的DNA1和5μM步驟3)得到的所述環(huán)化的DNA2與4mM核糖核苷酸混合物溶液、5UμL-1T7RNA聚合酶和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液混合，在37℃下孵育24小時，得到RNA膜；所述反應(yīng)緩沖液包括40mMTris-HCL、6mMMgCl2、2mM亞精胺和1mMDTT，pH值為7.9；
5)將步驟4)得到的RNA膜與步驟1)得到的魯米諾-金納米粒子溶液混合，37℃進行孵育反應(yīng)12h，得到魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜；
6)將步驟5)得到的魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜中加入20μM的Ramos適體溶液，25℃黑暗中溫育12h，得到適體和魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜；所述Ramos適體為在SEQ ID NO.3所示的序列的5’端標記有羧基的物質(zhì)；所述步驟1)與步驟2)～步驟4)沒有時間先后順序的限定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適體和魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜，其特征在于，所述步驟4)中核糖核苷酸混合物包括dATP、dGTP、dCTP和NH2-dUTP。
3.權(quán)利要求1或2所述適體和魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜的制備方法，包括以下步驟：
1)將HAuCl4溶液在加熱、攪拌的條件下與魯米諾溶液混合，得到魯米諾-金納米粒子溶液；
2)將5μM磷酸化的DNA1和5μM的引物1于水中混合，95℃保持2min，冷卻至25℃，加入T4連接酶和連接反應(yīng)緩沖液，25℃連接反應(yīng)12h，得到環(huán)化的DNA1；所述DNA1的序列如SEQ IDNO.1所示；所述引物1的序列如SEQ ID NO.4所示，或所述引物1為在SEQ ID NO.4所示的序列的5’端標記有巰基或生物素的物質(zhì)；
3)將5μM磷酸化的DNA2和5μM的引物1于水中混合，95℃保持2min，冷卻至25℃，加入T4連接酶和連接反應(yīng)緩沖液，25℃連接反應(yīng)12h，得到環(huán)化的DNA2；所述DNA2的序列如SEQ IDNO.2所示；
4)將5μM步驟2)得到的所述環(huán)化的DNA1和5μM步驟3)得到的所述環(huán)化的DNA2與4mM核糖核苷酸混合物溶液、5UμL-1T7RNA聚合酶和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液混合，在37℃下孵育24小時，得到RNA膜；所述反應(yīng)緩沖液包括40mMTris-HCL、6mMMgCl2、2mM亞精胺和1mMDTT，pH值為7.9；
5)將步驟4)得到的RNA膜與步驟1)得到的魯米諾-金納米粒子溶液混合，37℃進行孵育反應(yīng)12h，得到魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜；
6)將步驟5)得到的魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜中加入20μM的Ramos適體溶液，25℃黑暗中溫育12h，得到適體和魯米諾-金納米粒子功能化的RNA膜；所述Ramos適體為在SEQ ID NO.3所示的序列的5’端標記有羧基的物質(zhì)；
所述步驟1)與步驟2)～步驟4)沒有時間先后順序的限定。
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