[發(fā)明專利]用于心肌細(xì)胞分離提純的密度梯度液試劑盒及使用方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711340953.2
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN108165525A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董念國;劉保慶;李飛;尚小珂;史峰;邱雪峰;史嘉瑋;陳思;吳龍;劉雋煒;劉義華;胡行健;洪昊;李華東;孫永豐;喬韡華;李庚;朱鵬;李光周;王怡軒;劉發(fā)遠(yuǎn);謝飛;劉名;劉春耕;黃玉明
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 武漢智權(quán)專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42225
• 代理人: 張凱

本發(fā)明公開了一種用于心肌細(xì)胞分離提純的密度梯度液試劑盒及使用方法，涉及生物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，試劑盒包括第一試劑、第二試劑，其中：第一試劑包括超純水、Percoll液和緩沖液，其體積比為1：3：1；第二試劑包括超純水、Percoll液和緩沖液，其體積比為2：2：1；第一試劑和第二試劑中的緩沖液包括35.064?40.032份Nacl，1.975?2.013份Kcl，0.615?1.107份MgSO₄.7H₂O，4.865?5.226份葡萄糖，0.301?0.384份KH₂PO₄，0.213?0.365份Na₂HPO₄，23.830?29.788份4?羥乙基哌嗪乙磺酸。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于心肌細(xì)胞分離提純的密度梯度液試劑盒及使用方法。

背景技術(shù)

各種基因敲除及轉(zhuǎn)基因小鼠已廣泛應(yīng)用于心血管疾病動物模型的建立，已為心血管疾病機(jī)制的研究作出了巨大貢獻(xiàn)。體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)作為一種體外實(shí)驗(yàn)研究模型，可以排除神經(jīng)、體液的干擾而獨(dú)立地從細(xì)胞和分子水平研究心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，目前的工具鼠多為小鼠背景，而心肌細(xì)胞水平的研究多采用大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，相較于大鼠心肌原代細(xì)胞的分離純化技術(shù)及比較成熟的H9C2細(xì)胞系體系，小鼠心肌原代細(xì)胞的分離純化明顯不足。目前心肌原代細(xì)胞分離方法多采用胰酶膠原酶聯(lián)合消化或單一膠原酶消化，心肌細(xì)胞純化多采用差速貼壁法。

采用胰酶膠原酶聯(lián)合消化的缺陷是：胰酶對心肌細(xì)胞有一定的損傷極大地影響了心肌細(xì)胞的存活率，當(dāng)前雖極力減少細(xì)胞與胰酶的接觸時(shí)間及減少胰酶的消化時(shí)間，但對心肌細(xì)胞存活率的影響依然存在，這在小鼠心肌原代分離純化過程中尤為明顯。

采用單一膠原酶消化的缺陷是：雖然膠原酶作用較緩和，對細(xì)胞損傷較小，但后期需用化學(xué)抑制劑(如5-溴脫氧尿嘧啶)抑制成纖維細(xì)胞生長以期純化心肌。在小鼠心肌原代細(xì)胞培養(yǎng)中依然存在細(xì)胞存活率低、純度不高等缺陷，且化學(xué)抑制劑的存在是否影響心肌細(xì)胞的功能，尚有待證明，且化學(xué)抑制劑的存在將增加實(shí)驗(yàn)本身的影響因素，使結(jié)果出現(xiàn)難以預(yù)計(jì)的偏倚。

同時(shí)，采用差速貼壁法進(jìn)行心肌原代細(xì)胞分離純化的過程普遍需要3-3.5小時(shí)，純度、存活率在90％左右，且難以同時(shí)兼顧純度和存活率兩個(gè)方面。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供用于心肌細(xì)胞分離提純的密度梯度液試劑盒及使用方法，細(xì)胞存活率高、純度高。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種用于心肌細(xì)胞分離提純的密度梯度液試劑盒，所述試劑盒包括第一試劑、第二試劑，其中：

所述第一試劑包括超純水、Percoll液和緩沖液，其體積比為1：3：1；

所述第二試劑包括超純水、Percoll液和緩沖液，其體積比為2：2：1；

所述第一試劑和第二試劑中的緩沖液包括35.064-40.032份Nacl，1.975-2.013份Kcl，0.615-1.107份MgSO₄.7H₂O，4.865-5.226份葡萄糖，0.301-0.384份KH₂PO₄，0.213-0.365份Na₂HPO₄，23.830-29.788份4-羥乙基哌嗪乙磺酸。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述緩沖液還包括超純水和NaOH，所述緩沖液用超純水定容，用NaOH調(diào)整PH至7.5。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述第一試劑和所述第二試劑用于配制密度梯度液，所述密度梯度液用于使含有心肌細(xì)胞與非心肌細(xì)胞的細(xì)胞懸液分層。

本發(fā)明還公開了一種所述的用于心肌細(xì)胞分離提純的密度梯度液試劑盒的使用方法：