[發明專利]一種心肌細胞分離提純方法

在審

• 申請號: 201711340838.5
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN107881146A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 董念國;劉保慶;李飛;尚小珂;史峰;邱雪峰;史嘉瑋;陳思;吳龍;劉雋煒;劉義華;胡行健;洪昊;李華東;孫永豐;喬韡華;張超;王寅;李庚;朱鵬;劉名;代金池;白鵬;姜燁凡
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 武漢智權專利代理事務所(特殊普通合伙)42225
• 代理人: 張凱

技術領域

本發明涉及生物細胞培養技術領域，具體涉及一種心肌細胞分離提純方法。

背景技術

各種基因敲除及轉基因小鼠已廣泛應用于心血管疾病動物模型的建立，已為心血管疾病機制的研究作出了巨大貢獻。體外心肌細胞培養作為一種體外實驗研究模型，可以排除神經、體液的干擾而獨立地從細胞和分子水平研究心血管疾病的發生、發展機制，目前的工具鼠多為小鼠背景，而心肌細胞水平的研究多采用大鼠乳鼠心肌細胞，相較于大鼠心肌原代細胞的分離純化技術及比較成熟的H9C2細胞系體系，小鼠心肌原代細胞的分離純化明顯不足。目前心肌原代細胞分離方法多采用胰酶膠原酶聯合消化或單一膠原酶消化，心肌細胞純化多采用差速貼壁法。

采用胰酶膠原酶聯合消化的缺陷是：胰酶對心肌細胞有一定的損傷極大地影響了心肌細胞的存活率，當前雖極力減少細胞與胰酶的接觸時間及減少胰酶的消化時間，但對心肌細胞存活率的影響依然存在，這在小鼠心肌原代分離純化過程中尤為明顯。

采用單一膠原酶消化的缺陷是：雖然膠原酶作用較緩和，對細胞損傷較小，但后期需用化學抑制劑(如5-溴脫氧尿嘧啶)抑制成纖維細胞生長以期純化心肌。在小鼠心肌原代細胞培養中依然存在細胞存活率低、純度不高等缺陷，且化學抑制劑的存在是否影響心肌細胞的功能，尚有待證明，且化學抑制劑的存在將增加實驗本身的影響因素，使結果出現難以預計的偏倚。

同時，采用差速貼壁法進行心肌原代細胞分離純化的過程普遍需要3-3.5小時，純度、存活率在90％左右，且難以同時兼顧純度和存活率兩個方面。

發明內容

針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種心肌細胞分離提純方法，細胞存活率高、純度高。

為達到以上目的，本發明采取的技術方案是：一種心肌細胞分離提純方法，包括：

S1，將配好的包被液加入于六孔板中，37℃孵育；

S2，配制心肌緩沖液，將心肌緩沖液加入培養皿中，取心臟置于裝有心肌緩沖液的培養皿中漂洗；

S3，剪下的心臟組織置于裝有心肌緩沖液的離心管中；

S4，將0.05％Ⅱ型膠原酶加入裝有心臟組織的離心管中，搖床培養，棄上清；

S5，將0.1％Ⅱ型膠原酶加入步驟S4處理后的離心管中，搖床培養，取上清放入裝有血清的離心管中混勻；

S6，上清混勻后過濾、離心，離心后用心肌緩沖液重懸，將細胞懸液加入離心管中；

S7，配制密度梯度液，將細胞懸液緩慢加入配好的密度梯度液中，進行離心；

S8，離心后可見液面分層，先吸出最上層，再吸出中間層，將吸出的中間層置于離心管中，進行離心，離心后用10％不含青鏈霉素的胎牛血清溶液重懸，計數后將細胞接種于S1中漂洗好的六孔板中，置于37℃、5％CO₂溫箱中培養。

在上述技術方案的基礎上，所述包被液為層粘連蛋白包被液、多聚賴氨酸包被液和明膠包被液中的一種。

在上述技術方案的基礎上，按質量份計，所述心肌緩沖液包括7.012-8.007份Nacl，0.395-0.403份Kcl，0.123-0.222份MgSO₄.7H₂O，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份KH₂PO₄，0.042-0.071份Na₂HPO₄，4.766-5.958份4-羥乙基哌嗪乙磺酸。

在上述技術方案的基礎上，所述心肌緩沖液還包括超純水和NaOH，所述心肌緩沖液用超純水定容，用NaOH調整PH至7.5。

在上述技術方案的基礎上，所述密度梯度液由高密度液和低密度液配制而成，所述高密度液包括超純水、Percoll液和緩沖液，其體積比為1：3：1；所述低密度液包括超純水、Percoll液和緩沖液，其體積比為2：2：1；

按質量份計，所述緩沖液包括35.064-40.032份Nacl，1.975-2.013份Kcl，0.615-1.107份MgSO₄.7H₂O，4.865-5.226份葡萄糖，0.301-0.384份KH₂PO₄，0.213-0.365份Na₂HPO₄，23.830-29.788份4-羥乙基哌嗪乙磺酸。

在上述技術方案的基礎上，所述密度梯度液由高密度液和低密度液按體積比4:5配制而成。