[發明專利]一種心肌細胞分離提純方法

在審

• 申請號: 201711340838.5
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN107881146A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 董念國;劉保慶;李飛;尚小珂;史峰;邱雪峰;史嘉瑋;陳思;吳龍;劉雋煒;劉義華;胡行健;洪昊;李華東;孫永豐;喬韡華;張超;王寅;李庚;朱鵬;劉名;代金池;白鵬;姜燁凡
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 武漢智權專利代理事務所(特殊普通合伙)42225
• 代理人: 張凱

1.一種心肌細胞分離提純方法，其特征在于，包括：

S1，將配好的包被液加入于六孔板中，37℃孵育；

S2，配制心肌緩沖液，將心肌緩沖液加入培養皿中，取心臟置于裝有心肌緩沖液的培養皿中漂洗；

S3，剪下的心臟組織置于裝有心肌緩沖液的離心管中；

S4，將0.05％Ⅱ型膠原酶加入裝有心臟組織的離心管中，搖床培養，棄上清；

S5，將0.1％Ⅱ型膠原酶加入步驟S4處理后的離心管中，搖床培養，取上清放入裝有血清的離心管中混勻；

S6，上清混勻后過濾、離心，離心后用心肌緩沖液重懸，將細胞懸液加入離心管中；

S7，配制密度梯度液，將細胞懸液緩慢加入配好的密度梯度液中，進行離心；

S8，離心后可見液面分層，先吸出最上層，再吸出中間層，將吸出的中間層置于離心管中，進行離心，離心后用10％不含青鏈霉素的胎牛血清溶液重懸，計數后將細胞接種于S1中漂洗好的六孔板中，置于37℃、5％CO₂溫箱中培養。

2.如權利要求1所述的一種心肌細胞分離提純方法，其特征在于：所述包被液為層粘連蛋白包被液、多聚賴氨酸包被液和明膠包被液中的一種。

3.如權利要求1所述的一種心肌細胞分離提純方法，其特征在于：按質量份計，所述心肌緩沖液包括7.012-8.007份Nacl，0.395-0.403份Kcl，0.123-0.222份MgSO₄.7H₂O，0.973-1.046份葡萄糖，0.060-0.077份KH₂PO₄，0.042-0.071份Na₂HPO₄，4.766-5.958份4-羥乙基哌嗪乙磺酸。

4.如權利要求3所述的一種心肌細胞分離提純方法，其特征在于：所述心肌緩沖液還包括超純水和NaOH，所述心肌緩沖液用超純水定容，用NaOH調整PH至7.5。

5.如權利要求1所述的一種心肌細胞分離提純方法，其特征在于：所述密度梯度液由高密度液和低密度液配制而成，所述高密度液包括超純水、Percoll液和緩沖液，其體積比為1：3：1；所述低密度液包括超純水、Percoll液和緩沖液，其體積比為2：2：1；

按質量份計，所述緩沖液包括35.064-40.032份Nacl，1.975-2.013份Kcl，0.615-1.107份MgSO₄.7H₂O，4.865-5.226份葡萄糖，0.301-0.384份KH₂PO₄，0.213-0.365份Na₂HPO₄，23.830-29.788份4-羥乙基哌嗪乙磺酸。

6.如權利要求5所述的一種心肌細胞分離提純方法，其特征在于：所述密度梯度液由高密度液和低密度液按體積比4:5配制而成。

7.如權利要求5所述的一種心肌細胞分離提純方法，其特征在于：所述密度梯度液配制方法為：將所述高密度液懸空滴加入離心管中，再緩慢加入所述低密度液。

8.如權利要求1所述的一種心肌細胞分離提純方法，其特征在于：步驟S8后，將提純后的心肌細胞置于心肌細胞培養基中培養。

9.如權利要求1所述的一種心肌細胞分離提純方法，其特征在于：所述心肌細胞培養基為濃度10％的胎牛血清。