[發明專利]畢赤酵母基因敲除和抗性基因回收載體及構建方法與運用

有效

• 申請號: 201711340835.1
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN108004264B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 閆云君;焦梁成;周清華;宿智新;喬陽歌;楊凱欣
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 許恒恒;李智

1.一種畢赤酵母基因敲除的模板載體pAOXZ-mazf，其特征在于，該模板載體包括畢赤酵母甲醇型啟動子AOX1調控的mazf基因表達盒和博來霉素抗性基因表達盒；

所述mazf表達盒的5’端含有用于插入待敲除基因下游同源片段的酶切位點A，該酶切位點的5’端含有Cre特異性重組系統識別的lox66位點；

所述mazf表達盒的3’端含有用于插入待敲除基因上游同源片段的酶切位點B，該酶切位點的3’端含有Cre特異性重組系統識別的lox71位點；

所述博來霉素抗性基因表達盒位于所述lox66位點的5’端與所述lox71位點的3’端之間；

所述酶切位點A和酶切位點B為不同的酶切位點，且酶切位點A和酶切位點B在所述模板載體上唯一存在。

2.如權利要求1所述畢赤酵母基因敲除的模板載體pAOXZ-mazf的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）在大腸桿菌中擴增得到mazf基因，在mazf基因的兩端引入酶切位點；

（2）將步驟（1）得到的引入了酶切位點的mazf基因酶切后，得到暴露出粘性末端的mazf基因；將載體pPICZA經過酶切后，得到暴露出與mazf基因相同粘性末端的pPICZA載體；將所述暴露出粘性末端的mazf基因與暴露出相同粘性末端的pPICZA載體進行混合連接，將該連接了mazf基因的pPICZA載體轉化大腸桿菌感受態細胞，經含有博來霉素的平板篩選后，隨機挑選長出的克隆子抽質粒酶切驗證后，經測序驗證后命名為pPICZA-mazf；

（3）以步驟（2）得到的pPICZA-mazf為模板，使用引物lox66-F和lox71-R1第一輪 PCR擴增得到含有lox 66位點和mazf表達盒的片段，將該片段作為第二輪PCR的模板，使用引物lox66-F和lox71-R2通過第二輪PCR擴增得到兩端分別含有lox66和lox71位點的mazf表達盒片段；其中，所述lox66-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述lox71-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述lox71-R2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

（4）將步驟（3）得到的片段酶切后純化回收，然后與pPICZA-mazf載體酶切后純化回收含有抗生素基因部分的片段連接后，轉化大腸桿菌感受態細胞，經含有博來霉素的平板篩選，隨機挑選長出的克隆子抽質粒酶切驗證后，經測序驗證后命名為pAOXZ-mazf。