[發明專利]畢赤酵母基因敲除和抗性基因回收載體及構建方法與運用

有效

• 申請號: 201711340835.1
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN108004264B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 閆云君;焦梁成;周清華;宿智新;喬陽歌;楊凱欣
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 許恒恒;李智

本發明公開了畢赤酵母基因敲除和抗性基因回收載體及構建方法與運用，屬于微生物基因工程領域。本發明畢赤酵母基因敲除的模板載體包括畢赤酵母甲醇型啟動子AOX1調控的mazf基因表達盒以及兩端的lox71和lox66特異性重組酶識別位點和博來霉素抗性基因表達盒；本發明畢赤酵母基因抗性基因回收載體包括利用畢赤酵母甲醇型啟動子AOX1調控的mazf基因表達盒、利用GAP啟動子組成型表達的cre基因表達盒和HygB抗性基因表達盒。本發明極大地提高了畢赤酵母基因的敲除效率。本發明提供了基因敲除后抗生素標記回收的方法，為多基因的高效敲除提供了極大的便利，且敲除的效率高，使用的同源臂短。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，更具體地，涉及一種畢赤酵母基因敲除的方法。

背景技術

畢赤酵母(Pichia pastoris)是一類能以甲醇作為唯一碳源和能量來源進行生長的甲醇營養型酵母。畢赤酵母含有醇氧化酶AOX1強啟動子，這是目前調控機理最嚴格的啟動子之一，在甲醇為唯一碳源時，基因的表達可受甲醇嚴格調控。畢赤酵母表達系統因其生長速度快、易于基因遺傳轉化操作、有多種強啟動子可選擇、表達效率高、可實現高密度發酵等優點而被廣泛應用于各種外源蛋白質的表達，并獲得了較高的蛋白表達水平。

畢赤酵母體內無天然質粒存在，一般將載體整合入基因組內以形成穩定遺傳的轉化子。為了實現外源蛋白的高效表達或揭示某些未知基因的功能，往往需要對宿主進行一系列的遺傳操作以實現相應的生物學目的。其中，基因敲除作為一種常用的技術手段，被廣泛的應用于畢赤酵母的研究。

普遍使用的基因敲除手段是通過同源重組雙交換方式實現基因的插入失活或基因刪除。在傳統的釀酒酵母中進行基因敲除，往往只需要50bp左右的同源臂就能實現有效的基因敲除。然而，在一些非傳統酵母如畢赤酵母中，由于非同源末端連接修復機制導致基因敲除過程中雙交換事件發生的概率降低，為了實現相對高效的敲除，一般使用長度大于1000bp的同源臂，對于某些基因的敲除甚至需要超過2000bp的同源臂，盡管能夠實現敲除的目的，但敲除的成功率仍然相對較低。

目前，實現無抗性基因殘留的遺傳操作主要采取的是抗生素基因回收策略。主要包括基于位點特異性重組法(如Cre-loxp、Flp-Frt等重組系統)和利用自殺基因作為反篩選標記剔除法(如ura3基因在URA3營養缺陷型酵母作為自殺基因、大腸桿菌毒素蛋白MazF等)。然而利用URA3反向篩選標記，需要使用尿嘧啶缺陷型菌株，極大地限制了其應用范圍。

目前，主要有以下幾種方法應用于提高畢赤酵母基因敲除的效率。(1)通過增加同源臂的長度，提高同源重組雙交換發生的概率；(2)敲除畢赤酵母中ku70基因，通過破壞其非同源重組末端連接途徑，使得酵母內的基因修復主要通過同源重組途徑，從而提高敲除效率。然而非同源重組作為畢赤酵母體內重要的基因修復途徑之一，其功能的缺陷可能會造成宿主的穩定性降低或其他不可預知的缺陷；(3)通過構建輔助載體預先表達待敲除基因，通過增加基因的冗余彌補基因敲除后可能導致的生長缺陷實現基因的高效敲除。

盡管結合上述各種方法能實現畢赤酵母基因的敲除，然而畢赤酵母基因敲除的成功率仍然偏低，某些難敲除基因(比如α-1,6-甘露糖轉移酶基因och1等)的敲除往往需要篩選大量的克隆子而導致敲除過程十分困難，甚至得不到敲除成功的克隆子；或者在實現提高敲除效率的同時，殘留了標記基因，無法實現標記基因的重復利用，同時，多種篩選標記的殘存往往會留下潛在的遺傳風險。

因此，構建一種高效畢赤酵母基因敲除方法的同時實現敲除后標記基因的回收，具有重要的應用價值。

發明內容

針對現有技術中畢赤酵母基因敲除的成功率低、抗性敲除效率與基因敲除后篩選標記回收效率難以兼顧、使用的同源臂較長、敲除過程目的克隆子篩選工作量大等技術缺陷或改進需求，本發明提供了一種畢赤酵母基因敲除和抗性基因回收載體及構建方法與運用。