[發明專利]一種NAD類似物偏好型氧化還原酶的篩選方法

在審

• 申請號: 201711336831.6
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN109957602A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 趙宗保;劉玉雪;王雪穎;劉武軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12N1/21;C12N1/19;C12N1/13;C12R1/19;C12R1/865;C12R1/89
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明公開了一種NAD類似物偏好型氧化還原酶突變體的篩選方法。該方法中以亞磷酸敏感微生物為宿主，構建同時表達NAD類似物偏好型亞磷酸脫氫酶和NAD類似物供給功能蛋白的平臺菌株；利用編碼氧化還原酶突變體過表達系統的DNA樣品轉化平臺菌株細胞，并將轉化子在含有亞磷酸的環境中培養，在氧化還原酶突變體能再生NAD類似物的條件下，亞磷酸驅動亞磷酸脫氫酶突變體還原NAD類似物的同時被氧化成磷酸，菌株得以生長，所得生長正常的轉化子過表達的氧化還原酶即具備偏好NAD類似物的特性。利用該方法將氧化還原酶突變體對輔因子偏好性和催化效率與細胞生長相偶聯，用于高通量篩選表達NAD類似物偏好型氧化還原酶突變體菌株。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，旨在提供一種NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)類似物偏好型氧化還原酶的篩選方法，其基本原理是利用NAD類似物偏好型亞磷酸脫氫酶耦合氧化還原酶將培養環境中亞磷酸轉化為磷酸，從而使亞磷酸敏感微生物宿主細胞得以正常生長，并通過進一步分離鑒定得到NAD類似物偏好型氧化還原酶突變體。

背景技術

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)及其還原態NAD(P)H是生命過程中重要的輔酶，在細胞的能量代謝，信號傳遞，生長凋亡等生命過程中起到重要的作用(Ying,W.,et al.Antioxidants&Redox Signaling.2008,10,179)。由于NAD(P)參與胞內的多種氧化還原反應，并且NAD(P)⁺/NAD(P)H比例決定細胞內糖酵解，三羧酸循環等代謝途徑，進而影響細胞生長代謝及代謝物的積累，現階段通常采用輔因子工程對目標代謝途徑進行調控。如，促進NAD(P)再生，增加NAD(P)H的合成，降低NAD(P)H的消耗等。但是，由于NAD(P)是一種通用的輔酶，調控胞內NAD(P)水平或不同氧化還原態往往會對細胞生理及代謝等產生全局性影響，很難實現在輔酶水平對特定的氧化還原途徑進行調控。

利用NAD類似物為輔酶，構建依賴于NAD類似物的生物正交氧化還原體系，通過NAD類似物調控氧化還原途徑，而不影響其他利用NAD(P)的代謝途徑，同樣，其他代謝途徑中的NAD(P)也不會影響到生物正交代謝途徑，實現特異性調控目標代謝網絡，并對生物催化和合成生物學具有重要意義。目前已經報道的具有較好生物相容性的NAD類似物有：煙酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)，煙酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)，煙酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)，煙酰胺鳥嘌呤二核苷酸(NGD)(Ji,D.,et al.Journal of the American ChemicalSociety.2011,133,20857；趙宗保，王磊，劉武軍，一種NAD類似物的還原方法，申請號：201410117146.6)。同時也報道了一些可識別NAD類似物的酶，如蘋果酸酶(ME，GenbankP26616)L310R/Q401C突變體、NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、亞磷酸脫氫酶psPDH(Genbank 069054)L151V/D213Q突變體和rPDH(Genbank AEQ29500)I151R或I151R/E213C突變體。利用不同的NAD類似物偏好型氧化還原酶，可以建立依賴于NAD類似物的生物正交氧化還原體系，用于控制細胞內代謝過程。因此，篩選NAD類似物偏好型氧化還原酶成為構建基于NAD類似物的氧化還原代謝途徑和工程菌株的限制性因素。

目前，依賴于NAD類似物的氧化還原酶或NAD類似物合成酶主要通過突變篩選得到。篩選方法主要依賴于酶偶聯顯色法，將粗酶液與已有的能夠識別目標NAD類似物的氧化還原酶進行偶聯顯色，從而實現對突變文庫的篩選(Ji,D.,et al.Journal of theAmerican Chemical Society.2011,133,20857；趙宗保，王雪穎，劉玉雪，酶促合成煙酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，申請號：201510940681.4)。這種篩選方法過程繁瑣，篩選周期長，很難實現快速的高通量篩選，而有效的高通量篩選方法如流式細胞儀和微流控技術均尚不能應用于NAD類似物偏好型氧化還原酶突變體的篩選，因此篩選方法成為篩選NAD類似物偏好型氧化還原酶的主要限制性因素。