[發(fā)明專利]一種NAD類似物偏好型氧化還原酶的篩選方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201711336831.6
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN109957602A
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙宗保;劉玉雪;王雪穎;劉武軍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12N1/21;C12N1/19;C12N1/13;C12R1/19;C12R1/865;C12R1/89
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種NAD類似物偏好型氧化還原酶的篩選方法，其特征在于：以亞磷酸敏感微生物為宿主，構(gòu)建同時表達NAD類似物偏好型亞磷酸脫氫酶和NAD類似物供給功能蛋白的平臺菌株；利用氧化還原酶突變體表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)化平臺菌株細胞，并將轉(zhuǎn)化子在含有亞磷酸的環(huán)境中培養(yǎng)，所得生長正常的轉(zhuǎn)化子過表達的氧化還原酶即具備識別NAD類似物的特性。

2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于：所述NAD類似物為煙酰胺胞嘧啶二核苷酸，煙酰胺胸腺嘧啶二核苷酸，煙酰胺尿嘧啶二核苷酸，或煙酰胺鳥嘌呤二核苷酸中的一種或兩種以上。

3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于：所述亞磷酸敏感微生物為在不能代謝亞磷酸的微生物，包括原核微生物大腸桿菌，真核微生物為釀酒酵母、衣藻中的一種或兩種。

4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于：所述亞磷酸化合物濃度為1.0mM-500mM。

5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于：所述NAD類似物供給功能蛋白為NAD類似物轉(zhuǎn)運蛋白或具有NAD類似物合成能力的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體；

所述NAD類似物轉(zhuǎn)運蛋白為具備將NAD類似物轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)的活性蛋白，包括衣原體來源的NAD轉(zhuǎn)運蛋白NTT4或擬南芥來源的NAD轉(zhuǎn)運蛋白AtNDT4中的一種或兩種；

所述具有NAD類似物合成能力的煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶突變體，包括來源于Francisella tularensis的NadM突變體NadM-H110R/N132Y/F136K，NadM-K112Y/Y133E，來源于E.coli的NadD突變體NadD-P22G/Y84A/C132D，NadD-L26F/T85G/T174V，來源于E.coli的NadR突變體NadR-L83R/I206P或NadR-A87L/S207E中的一種或兩種以上。

6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于：所述NAD類似物偏好型亞磷酸脫氫酶為野生亞磷酸脫氫酶經(jīng)基因工程突變得到的突變體，包括來源于Ralstonia sp.Strain 4506的亞磷酸脫氫酶rPDH突變體rPDH-I151R，rPDH-I151R/P176D，rPDH-I151R/M207A，rPDH-I151R/P176Q/M207G，來源于Pseudomonas stutzeri WM88亞磷酸脫氫酶psPDH的突變體psPDH-L151R或psPDH-L151R/D213E中的一種或兩種以上。

7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于：所述的氧化還原酶為可催化轉(zhuǎn)化還原型輔酶NADH或NADPH，生成氧化型輔酶NAD或NADP的酶，包括但不局限于NADH或NADPH依賴型催化底物還原的酶，羰基還原酶，氧化還原蛋白還原酶，還原羧化酶，氰基或過氧化物還原酶；NADH或NADPH依賴型催化底物氧化的單加氧酶；

羰基還原酶包括但不局限于乳酸脫氫酶，β-羥甲基戊二酰輔酶A還原酶；還原羧化酶為蘋果酸酶；氰基還原酶為7-氰基-7-碳鳥嘌呤還原酶，過氧化物還原酶為過氧氫化脂肪酸還原酶；氧化還原蛋白還原酶包括但不局限于鐵-硫蛋白還原酶，甲苯-2,3-雙加氧酶還原酶；單加氧酶包括但不局限于細胞色素P450單加氧酶P450_BM3，苯乙烯單加氧酶或環(huán)己烷酮單加氧酶。

8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于：所述氧化還原酶突變體表達系統(tǒng)，為攜帶氧化還原酶突變體編碼基因的表達載體或表達盒中的一種或兩種；

氧化還原酶突變體包括但不局限于乳酸脫氫酶V152X/I177X，β-羥甲基戊二酰輔酶A還原酶G186X/V328X，P450單加氧酶P450_BM3V901X/R966X/T974X/W1046X，蘋果酸酶Q401X，過氧氫化脂肪酸還原酶G21X/V133X，苯乙烯單加氧酶P152X/I184X/T210X，鐵-硫蛋白還原酶S182X/N223X/M226X，甲苯-2,3-雙加氧酶還原酶M144X/V149X，X為20種常見氨基酸的任何一種。

9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于：所得NAD類似物偏好型氧化還原酶突變體，應用于構(gòu)建基于NAD類似物的氧化還原代謝途徑和工程菌株。