[發明專利]特異性高表達棕櫚酰化缺失MTDH的MDA-MB-231細胞株及構建方法

有效

• 申請號: 201711336611.3
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN109957581B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 樸海龍;劉曉龍;李同明
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種內源MTDH敲除而棕櫚酰化缺失MTDH特異性高表達的MDA-MB-231細胞株的構建方法，其特征在于：以乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞作為宿主細胞，通過CRISPR/Cas9基因敲除和突變基因過表達兩步實現敲除野生型MTDH而表達突變型MTDH；所述突變后MTDH基因序列如下：

ATGGCTGCACGGAGCTGGCAGGACGAGCTGGCCCAGCAGGCCGAGGAGGGCTCGGCCCGGCTGCGGGAAATGCTCTCGGTCGGCCTACCCTTTCTGCGCACCGAGCTGGGCCTCGACCTGGGGCTGGAGCCGAAACGGTACCCCGGCTGGGTGATCCTGGTGGGCACTGGCGCGCTCGGGCTGCTGCTGCTGTTTCTGCTGGGCTACGGCTGGGCCGCGGCTAGTGCCGGCGCCCGCAAAAAGCGGAGGAGCCCGCCCCGCAAGCGGGAGGAGGCGGCGGCCGTGCCGGCCGCGGCCCCCGACGACCTGGCCTTGCTGAAGAATCTCCGGAGCGAGGAACAGAAGAAGAAGAACCGGAAGAAACTGTCCGAGAAGCCCAAACCAAATGGGCGGACTGTTGAAGTGGCTGAGGGTGAAGCTGTTCGAACACCTCAAAGTGTAACAGCAAAGCAGCCACCAGAGATTGACAAGAAAAATGAAAAGTCAAAGAAAAATAAGAAGAAATCAAAGTCAGATGCTAAAGCAGTGCAAAACAGTTCACGCCATGATGGAAAGGAAGTTGATGAAGGAGCCTGGGAAACTAAAATTAGTCACAGAGAGAAACGACAGCAGCGTAAACGTGATAAGGTGCTGACTGATTCTGGTTCATTGGATTCAACTATCCCTGGGATAGAAAATACCATCACAGTTACCACCGAGCAACTTACAACCGCATCATTTCCTGTTGGTTCCAAGAAGAATAAAGGTGATTCTCATCTAAATGTTCAAGTTAGCAACTTTAAATCTGGAAAAGGAGATTCTACACTTCAGGTTTCTTCAGGATTGAATGAAAACCTCACTGTCAATGGAGGAGGCTGGAATGAAAAGTCTGTAAAACTCTCCTCACAGATCAGTGCAGGTGAGGAGAAGTGGAACTCCGTTTCACCTGCTTCTGCAGGAAAGAGGAAAACTGAGCCATCTGCCTGGAGTCAAGACACTGGAGATGCTAATACAAATGGAAAAGACTGGGGAAGGAGTTGGAGTGACCGTTCAATATTTTCTGGCATTGGGTCTACTGCTGAGCCAGTTTCTCAGTCTACCACTTCTGATTATCAGTGGGATGTTAGCCGTAATCAACCCTATATCGATGATGAATGGTCTGGGTTAAATGGTCTGTCTTCTGCTGATCCCAACTCTGATTGGAATGCACCAGCAGAAGAGTGGGGCAATTGGGTAGACGAAGAAAGAGCTTCACTTCTAAAGTCCCAGGAACCAATTCCTGATGATCAAAAGGTCTCAGATGATGATAAAGAAAAGGGAGAGGGAGCTCTTCCAACTGGGAAATCCAAAAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAGAAGCAAGGTGAAGATAACTCTACTGCACAGGACACAGAAGAATTAGAAAAAGAGATTAGAGAAGACCTTCCAGTGAATACCTCTAAAACCCGTCCAAAACAGGAAAAAGCTTTTTCCTTGAAGACCATAAGCACTAGTGATCCAGCCGAAGTACTCGTCAAAAATAGCCAGCCTATCAAGACTCTTCCACCTGCTACTTCTACCGAGCCATCTGTAATCTTATCAAAAAGTGATTCTGACAAGAGCTCTTCCCAAGTGCCGCCAATACTACAAGAGACAGATAAATCCAAGTCAAATACCAAGCAAAATAGTGTGCCTCCTTCACAGACCAAGTCTGAAACTAGCTGGGAATCTCCCAAACAAATAAAAAAGAAGAAAAAAGCCAGACGAGAAACGTGA；

所述構建方法包括以下步驟：

1)將野生型MTDH的sgRNA序列連至Lentivirus V2慢病毒載體中，得sgMTDH載體；

2）轉染前24~48 h將用于慢病毒包裝的細胞HEK293T接種于細胞培養皿；

3）在HEK293T細胞中以1:9:10的質量比例轉染4~6μg包裝質粒及病毒質粒，分別為pVSV-G : pSPAX2 : sgRNA,包含sgControl及sgMTDH；

3) 轉染8~12 h后吸去培養基并加入10ml DMEM培養基；

4) 感染前24~48 h將靶細胞MDA-MB-231接種于dish以使感染時細胞密度達到50%左右；

5) 轉染后48~72 h，將上清放入離心管中，3000 rpm轉離心10分鐘，吸取上清并用0.45μm的濾膜過濾，得到所需病毒液，加入到待感染的MDA-MB-231細胞中并同時加入終濃度5 μg/ml polybrene；

6) 感染的MDA-MB-231細胞培養8~24 h后吸去培養基，換用DMEM培養基轉至dish中，繼續培養；

7) 用含3~8 μg/ml puromycin的DMEM培養基換液對細胞進行篩選，48 h后將存活的細胞挑取單克隆放入96孔板培養至足夠數量后，提取蛋白，通過Western blot檢測MTDH的表達量；

8）使用點突變的方式在MTDH基因序列中進行兩次定點突變；首先在編碼棕櫚酰化位點Cys75的基因序列處設計突變引物，使Cys75密碼子TGC突變為AGT，進一步將所設計sgRNA序列附近的PAM序列AGG突變為ACC，避免CRISPR/Cas9系統對外源表達MTDH的敲除，將雙突變的MTDH序列連至pLoc過表達載體中，得pLoc-MTDH-C75S-AGG87ACC；

9）轉染前24~48 h將用于慢病毒包裝的細胞HEK293T接種于細胞培養皿；

10）在293T細胞中以1:9:10的比例轉染5 μg包裝質粒及病毒質粒，分別為pVSV-G :pSPAX2 : 過表達載體pLoc-MTDH-C75S-AGG87ACC；

11) 轉染8-12 h后吸去培養基并加入DMEM培養基；

12) 病毒感染前24~48 h將之前篩選MTDH成功敲除的MDA-MB-231細胞接種于dish以使實驗時細胞密度達到50%左右；

13) 轉染后48~72 h，將含有病毒的DMEM培養基轉移至離心管中，3000rpm轉離心10分鐘，吸取上清并用0.45 μm的濾膜過濾，得到所需病毒液，加入到待感染的MTDH敲除的MDA-MB-231細胞中并同時加入終濃度5 μg/ml polybrene；

14) 病毒干擾8~24 h后吸去含病毒的培養基，換用DMEM培養基繼續培養24~48 h；

15) 用含10~20 μg/ml BSH的培養基換液對細胞進行篩選，提取細胞RNA，反轉錄后檢測其中MTDH mRNA序列；提取蛋白，通過Western blot檢測MTDH的表達量。