[發明專利]特異性高表達棕櫚酰化缺失MTDH的MDA-MB-231細胞株及構建方法

有效

• 申請號: 201711336611.3
• 申請日: 2017-12-14
• 公開（公告）號: CN109957581B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 樸海龍;劉曉龍;李同明
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種敲除野生型MTDH后重新高表達棕櫚酰化缺失MTDH的MDA?MB?231細胞株及其構建方法。利用CRIPR/Cas9系統將乳腺癌細胞系MDA?MB?231中內源表達的MTDH進行敲除，之后通過定點突變的方式構建MTDH中棕櫚酰化位點和sgRNA識別序列處Protospacer Adjacent Motif(PAM)位點同時突變的MTDH表達載體，借助慢病毒體系和抗性篩選獲得特異性高表達棕櫚酰化缺失MTDH的MDA?MB?231細胞株。經測序和Western Blot檢測細胞株中MTDH突變及高表達，最終成功構建內源MTDH敲除而棕櫚酰化缺失MTDH特異性高表達的細胞株，可作為研究MTDH棕櫚酰化修飾在乳腺癌發生發展中的分子作用機制及所參與代謝調控過程的理想細胞株。

技術領域

本發明是構建一種敲除內源性MTDH，外源高表達棕櫚酰化缺失MTDH的MDA-MB-231細胞株的構建方法，涉及生物醫學領域。

背景技術

棕櫚酰化修飾發現至今已有四十多年的歷史，但對其生物學功能以及在腫瘤中的研究卻是近幾年剛剛開始，它能夠調控靶蛋白的胞內運輸、亞細胞定位、活性、穩定性、蛋白相互作用等。MTDH作為一種在絕大多數癌癥中高表達的癌基因，對腫瘤的研究和治療具有更為重要的意義，但對其活性和功能的認識卻仍處于初期階段，尤其是對調控定位和功能的棕櫚酰化修飾，迄今尚無相關研究，嚴重限制了MTDH在腫瘤診斷和治療中的轉化應用。研究證實MTDH能夠發生棕櫚酰化修飾；生物信息學分析顯示，MTDH序列中僅存在唯一一個半胱氨酸殘基(第75位)，即其棕櫚酰化位點，并預測了可能的酰基轉移酶。對于MTDH棕櫚酰化修飾的研究，對腫瘤中新的腫瘤標志物及腫瘤發生發展的研究具有重要意義，同時也可用于臨床早期診斷、預后判斷等輔助性治療。

發明內容

本發明的目的是提供一種借助多種分子細胞生物學手段抑制內源蛋白表達，而使突變型該蛋白外源高表達的方法，并進一步使用該方法構建相應的細胞模型，用于研究目標蛋白的功能以及突變位點的生物學功能，而避免內源野生型蛋白的干擾。

本發明提供的一種特異性高表達棕櫚酰化缺失MTDH蛋白的MDA-MB-231穩定細胞株，是以乳腺癌MDA-MB-231細胞系作為宿主細胞，通過CRISPR/Cas9敲除內源MTDH表達，進一步回補表達突變型MTDH并通過不同的抗性篩選獲得的穩定細胞株，構建過程包括MTDHsgRNA的設計、CRISPR/Cas9系統的包裝及慢病毒感染、MTDH敲除細胞株的鑒定、棕櫚酰化位點及PAM序列雙突變MTDH表達載體的構建、慢病毒的包裝及感染、突變型MTDH過表達細胞株的鑒定。

特異性高表達棕櫚酰化缺失MTDH的MDA-MB-231細胞株的構建方法，是一種內源MTDH敲除而棕櫚酰化位點突變MTDH特異性高表達的MDA-MB-231細胞株的構建方法，其特征在于：以乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞作為宿主細胞通過基因敲除(CRISPR/Cas9)和突變基因過表達兩步篩選實現敲除野生型MTDH而回補突變型MTDH表達；雙突變后MTDH基因序列如下：