[發(fā)明專利]一種用維生素C、L-半胱氨酸和亞硫酸氫鈉防止煙草外植體褐化的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711331461.7
• 申請(qǐng)日: 2017-12-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108112475A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧樂(lè)樂(lè);曾婉俐;許力;蔣佳芮;張建鐸;向海英;宋春滿;張濤;蘇楊;李雪梅;陳章玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00;A01C1/08;A01C1/00
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生

本發(fā)明是一種用維生素C、L?半胱氨酸和亞硫酸氫鈉防煙草外植體褐化的方法，包括如下步驟：植物種子的消毒、植物種子培養(yǎng)、煙草外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)、外植體增殖培養(yǎng)后進(jìn)行外植體愈傷組織防褐化培養(yǎng)，所述的防褐化培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基中加入防褐添加劑20?100mg/L維生素C，50?300mg/L L?半胱氨酸，50?100mg/L亞硫酸氫鈉，30g/L蔗糖，4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.7。褐化培養(yǎng)處理后，可以有效緩解褐化現(xiàn)象，改善外植體整體的分化狀態(tài)。添加維生素C、L?半胱氨酸和亞硫酸氫鈉在培養(yǎng)基中，具有使用方便、成本低、效果好等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種用維生素C、L-半胱氨酸和亞硫酸氫鈉防煙草外植體褐化的方法。

背景技術(shù)

煙草（Nicotiana tabacum）是茄科一年生草本植物，并作為一種歷史悠久的藥用植物，同時(shí)具有醫(yī)療價(jià)值。《全國(guó)中草藥匯編》記載，煙草性溫味甘，有毒，具有消腫、解毒、殺蟲(chóng)等功效，主要用于疔瘡腫毒，頭癬，白癬，禿瘡，毒蛇咬傷等癥，還可治療項(xiàng)疽、背癰、風(fēng)痰等病。也可用于滅釘螺、蚊、蠅、老鼠和殺蟲(chóng)等。它還是重要的經(jīng)濟(jì)作物，更是國(guó)家和地方財(cái)稅的重要經(jīng)濟(jì)來(lái)源。

植物組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體發(fā)生褐化是影響組織培養(yǎng)的重要因素，對(duì)于引起植物組織褐化的因素主要是受植物的基因型、外植體影響、培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基等影響。由于褐化對(duì)于外植體材料產(chǎn)生的毒害作用，將進(jìn)一步影響植物材料的生長(zhǎng)和分化，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡。盡管引起褐化現(xiàn)象的因素較多，但選擇合適的外植體，篩選合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件能有效地防止褐化^[1]。

但是煙草在組織培養(yǎng)過(guò)程中的褐化問(wèn)題是多發(fā)的常見(jiàn)的，幾乎不可避免，褐化會(huì)導(dǎo)致植株的死亡，也就是培養(yǎng)基中的植物不能繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，所以防止褐化是在煙草組織培養(yǎng)中要極力解決的問(wèn)題。

本發(fā)明利用在培養(yǎng)基中添加防褐劑維生素C、L-半胱氨酸和亞硫酸氫鈉緩解煙草外植體褐化，相關(guān)方法未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種用維生素C、L-半胱氨酸和亞硫酸氫鈉防煙草外植體褐化的方法；該方法可以對(duì)植物組培過(guò)程中出現(xiàn)的褐化問(wèn)題得到有效緩解，進(jìn)而對(duì)植物組織培養(yǎng)具有重要作用。

本發(fā)明采用解決技術(shù)問(wèn)題方案如下：

一種防止煙草外植體褐化的方法，包括如下步驟：

步驟1：植物種子的消毒：取飽滿的煙草種子，然后移至超凈工作臺(tái)上，用75％酒精將種子浸泡30s，無(wú)菌水沖洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，無(wú)菌水浸泡清洗5次，用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面水分后進(jìn)行接種，其中無(wú)菌水為經(jīng)高壓滅菌的超純水；

步驟2：植物種子培養(yǎng)：將步驟(1)得到的消毒后的種子接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25±1℃，光照強(qiáng)度30-50μmol/(m²·s)，光照時(shí)間為16h/d的條件下培養(yǎng)60d，種子發(fā)芽長(zhǎng)成有幼苗，所述MS培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+4g/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.7 ；

步驟（3），煙草外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟(2)中得到的幼苗置于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，控制白天溫度為28℃，夜間溫度為25℃，光照強(qiáng)度為30-50μmol/(m²·s)，光照時(shí)間為16小時(shí)/天，培養(yǎng)時(shí)間為18天，誘導(dǎo)得到煙草外植體愈傷組織，誘導(dǎo)率為46.2-95.8％，所述MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS基本培養(yǎng)基+1-2mg/L6-芐基腺嘌呤6-BA+0.2-0.5mg/L噻重氮苯基脲TDZ+0.1-1.0mg/L萘乙酸NAA+0.1-1.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D+30g/L蔗糖+4.5g/L瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為5.7；