[發明專利]一種用維生素C、L-半胱氨酸和亞硫酸氫鈉防止煙草外植體褐化的方法

在審

• 申請號: 201711331461.7
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN108112475A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 鄧樂樂;曾婉俐;許力;蔣佳芮;張建鐸;向海英;宋春滿;張濤;蘇楊;李雪梅;陳章玉
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01C1/08;A01C1/00
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 金耀生

1.一種用維生素C、L-半胱氨酸和亞硫酸氫鈉防煙草外植體褐化的方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟1：植物種子的消毒;

步驟2：植物種子培養：將步驟(1)得到的消毒后的種子接種到MS培養基中，在培養溫度為25±1℃，光照強度30-50μmol/(m²·s)，光照時間為16h/d的條件下培養60d，種子發芽長成有幼苗，所述MS培養基為MS基本培養基+30g/L蔗糖+4g/L的瓊脂，培養基的pH值為5.7 ；

步驟（3），煙草外植體誘導培養：將步驟(2)中得到的幼苗置于MS誘導培養基中，控制白天溫度為28℃，夜間溫度為25℃，光照強度為30-50μmol/(m²·s)，光照時間為16小時/天，培養時間為18天，誘導得到煙草外植體愈傷組織，誘導率為46.2-95.8％，所述MS誘導培養基為：MS基本培養基+1-2mg/L6-芐基腺嘌呤6-BA+0.2-0.5mg/L噻重氮苯基脲TDZ+0.1-1.0mg/L萘乙酸NAA+0.1-1.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D+30g/L蔗糖+4.5g/L瓊脂，培養基的pH值為5.7；

步驟（4），煙草外植體增殖培養：將步驟(3)中得到的煙草外植體愈傷組織置于MS增殖培養基中，控制白天溫度為28℃，夜間溫度為25℃，光照強度為30-50μmol/(m²·s)，光照時間為16小時/天，培養時間為7天，煙草外植體愈傷組織逐漸分化增殖，增殖率為49.7-64.3％；所述的MS增殖培養基為：MS基本培養基中加入0.1-1.0mg/L的6-芐基腺嘌呤6-BA、0.5-2.0mg/L萘乙酸NAA、0.1-0.5mg/L激動素KT、30g/L蔗糖、4.5 g/L瓊脂，培養基的pH值為5.7；

步驟（5），煙草外植體防褐化培養：將步驟(4)中得到的煙草外植體愈傷組織置于MS防褐化培養基中，控制白天溫度為28℃，夜間溫度為25℃，光照強度為30-50μmol/(m2·s)，光照時間為16小時/天，培養時間為40天，煙草外植體愈傷組織褐化率為8.2-31.7％；MS防褐化培養基為：MS基本培養基中加入防褐添加劑20-100mg/L維生素C，50-300mg/L L-半胱氨酸、50-100mg/L亞硫酸氫鈉、30g/L蔗糖、4g/L瓊脂，培養基的pH值為5.7，防褐添加劑維生素C與L-半胱氨酸的加入是在培養基冷卻至50℃左右加入。

2.根據權利要求1所述的用維生素C、L-半胱氨酸和亞硫酸氫鈉防煙草外植體褐化的方法，其特征在于：步驟1中所述的植物種子的消毒是：取飽滿的植物種子移至超凈工作臺上，用75％酒精將植物種子浸泡30s，無菌水沖洗2遍，再用1％AgNO₃消毒10min，無菌水浸泡清洗5次，用無菌濾紙吸干植物種子表面水分后進行接種，所述的無菌水為經高壓滅菌的超純水。