[發明專利]一種檢測葉螨對阿維菌素抗性相關基因突變的CAPS標記方法

在審

• 申請號: 201711330419.3
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN107841539A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 王少麗;徐丹丹;何艷艷;張友軍;吳青君;謝文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所11039
• 代理人: 劉江良

技術領域

本發明屬于生物技術技術領域，具體涉及一種檢測葉螨對阿維菌素抗性相關基因突變的CAPS標記方法。

背景技術

二斑葉螨Tetranychus urticae Koch是果樹、蔬菜及其他農作物上的世界性重大農業害螨。二斑葉螨以成螨、若螨刺吸為害植物汁液，初期葉片變黃影響光合作用，嚴重者導致葉片枯死、落葉甚至整株枯死，對農作物健康生長及產品質量帶來嚴重影響。

二斑葉螨由于體型微小、生活史短、世代重疊嚴重，田間化學藥劑的頻繁使用導致了其抗藥性的出現。據報道，二斑葉螨田間種群已經對不同類型的殺蟲劑均產生了不同程度的抗藥性（Van Leeuwen et al.，2010；Tang et al., 2014，王玲等，2015），其中尤以對阿維菌素抗藥性最為明顯，部分地區二斑葉螨種群抗性水平達上千倍（Tang et al., 2014），包括卵期對阿維菌素的抗藥性也顯著升高（劉慶娟等，2012）。靶標抗性是害蟲對殺蟲劑產生抗性的重要抗性機制之一，谷氨酸門控氯離子通道（Glutamate-gated chloride channel, GluCl）在葉螨對阿維菌素產生抗藥性的相關靶標抗性基因，抗性種群中GluCl1基因第三跨膜區的G314D點突變是導致二斑葉螨對阿維菌素產生抗藥性的重要分子機制（Kwon et al., 2010），該突變位點在我國二斑葉螨田間種群也存在，并且抗性基因頻率很高（唐小鳳等，2014年）。隨后研究者又在希臘的一個頻繁噴施阿維菌素的溫室月季二斑葉螨MAR-AB種群中，發現了GluCl家族的GluCl3基因上存在G326E位點的突變，并證實了該突變也與二斑葉螨對阿維菌素抗性產生抗藥性有關（Dernauw et al., 2012）。我國多地二斑葉螨田間種群對阿維菌素抗藥性屬高抗性或極高抗性水平（Tang et al., 2014），田間種群是否也存在該位點的突變以及突變頻率高低尚不明確。

害蟲/害螨中抗藥性基因一旦發生了突變，即使停用該藥劑，也不能回復葉螨對其的敏感性，因此檢測抗性基因的突變與否、突變頻率的高低，進而明確測試種群的抗藥性，對于指導田間下一步藥劑的科學選擇和施用，很有必要性而且意義重大。常規的害螨抗藥性監測方法是基于生物測定方法，比如FAO推薦的玻片浸漬法，應用普遍，但這種方法存在不少缺點：（1）操作過程很精細，需要極小心，才能保證測試葉螨不被傷害；（2）操作者需要較長一段時間來掌握該技術；（3）生物測定過程需要藥劑處理后48h才能觀察結果，進行害螨死亡率的判斷。而基于PCR為基礎的基因點突變檢測方法需要通過以下幾個步驟：基因擴增、片段測序和序列比對等過程來確定抗性相關基因是否發生了突變，但很明顯這樣的過程費時費力，也耗費更多物力。本實驗室前期工作中，我們實驗室對二斑葉螨抗性基因片段的序列進行分析比較，發現葉螨抗性和敏感種群之間的抗性基因GluCl3擴增片段由于一個核苷酸的突變導致的酶切位點變化，由此建立一種基于酶切擴增多態性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，簡稱CAPS）的分子標記技術。這種快速的檢測方法更加經濟高效，特異性強，節約人力和物力，還可明確測試害蟲/螨種群對阿維菌素的抗藥性，實現害蟲/螨抗藥性的早期發現和預警。

發明內容

為了實現對田間種群抗藥性的快速檢測，本發明克隆了二斑葉螨抗性和敏感種群的GluCl 3基因片段，比較分析二者序列差異的基礎上，建立了一種基于抗性基因點突變位點檢測的葉螨對阿維菌素抗藥性的快速分子檢測技術，即酶切擴增多態性序列標記（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，簡稱CAPS）技術，可以實現葉螨種群/個體抗藥性的早期預警，有助于田間種群的抗藥性治理和針對性高效防控。

本發明提供的技術方案是：一種檢測葉螨對阿維菌素抗性相關基因突變的CAPS標記方法：通過擴增待測葉螨種群中GluCl 3基因包含G326E突變的基因片段，并進行酶切位點分析，其中敏感種群的擴增片段中存在Hinf I酶切位點，而抗性純合種群中不存在該位點，抗性雜合種群既存在Hinf I酶切位點，也存在無該位點的擴增片段。

所述的檢測方法，擴增所用的引物如下：

上游引物：5'-GATCCAAATGCTATTCCTGCC-3'，