[發(fā)明專利]一種檢測葉螨對阿維菌素抗性相關(guān)基因突變的CAPS標(biāo)記方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201711330419.3 | 申請日： | 2017-12-13 |
| 公開（公告）號： | CN107841539A | 公開（公告）日： | 2018-03-27 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王少麗;徐丹丹;何艷艷;張友軍;吳青君;謝文 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6858 | 分類號： | C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 北京知本村知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所11039 | 代理人： | 劉江良 |
| 地址： | 100081 北*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 檢測 菌素 抗性 相關(guān) 基因突變 caps 標(biāo)記 方法 | ||
1.一種檢測葉螨對阿維菌素抗性相關(guān)基因突變的CAPS標(biāo)記方法，其特征在于：通過對擴增待測葉螨種群GluCl 3基因包含G326E突變的基因片段，并進行酶切位點分析，其中敏感種群的擴增片段中存在Hinf I酶切位點，而抗性純合種群中不存在該位點，抗性雜合種群既存在包含Hinf I酶切位點的擴增片段，也存在無該位點的擴增片段。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于：擴增所用的引物如下：
上游引物：5'-GATCCAAATGCTATTCCTGCC-3'，
下游引物：5'-GAGGGAAACCCATACCACCAC-3'。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于：采用的PCR 擴增體系：10 mL 的 2×Es Mix (0.1 U Taq E/mL)，1 mL 的 DNA 模板，10 mmol/L的上游和下游引物各 1 mL，最后用 dd H2O 補充至 20 mL。
4.如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于：所用的擴增程序為：95℃預(yù)變性 3 min；之后進行35 個循環(huán)（95℃變性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 1 min）；最后在 72℃條件下延伸 2 min。
5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的檢測方法，其特征在于：擴增片段經(jīng)Hinf I酶切，結(jié)果為抗性純合子得到370bp左右的條帶，敏感純合子酶切成150bp和220bp左右的兩條帶，抗性雜合子則顯示出150bp、220bp和370bp左右的三條帶。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于：對PCR產(chǎn)物的酶切體系：10′NE Buffer：5 mL，Hinf I I mL，PCR產(chǎn)物10 mL，dd H2O補足至50 mL，37℃條件下保持5~15 min。
7.一種利用權(quán)利要求1至6任一項所述檢測方法對葉螨田間種群進行抗性基因突變頻率的檢測方法，其特征在于：對田間種群的葉螨進行所述檢測，并按下述計算抗性基因突變頻率：點突變的基因突變頻率（%）=[（抗性純合子個體數(shù)/檢測總數(shù)）+（抗性雜合子個體數(shù)/檢測總數(shù)/2）]′100。
8.如權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于：對田間種群的30頭葉螨進行所述檢測。
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