[發(fā)明專利]定量檢測轉(zhuǎn)基因玉米中抗蟲蛋白Vip3Aa20的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法

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• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN107894510A
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉衛(wèi)曉;李亮;金蕪軍;宛煜嵩;黃衛(wèi)紅;苗朝華;高進(jìn);董美;王迪;胡曉穎;安娜
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京中譽(yù)威圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11279
• 代理人: 葉立濤,周際

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及到定量檢測轉(zhuǎn)基因玉米中抗蟲蛋白 Vip3Aa20的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一種廣泛存在于土壤中的革蘭氏陽性菌，在營養(yǎng)生長期分泌具有高抗蟲活性的可溶蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,Vip proteins)。在接種15個(gè)小時(shí)至產(chǎn)孢期，菌液上清均可檢測到Vip3蛋白的表達(dá)。抗蟲蛋白Vip3對鱗翅類(Lepidoptera)昆蟲有廣泛毒性，當(dāng)昆蟲取食Vip3蛋白后，該蛋白經(jīng)中腸蛋白酶活化，活化的蛋白穿透圍食膜，與中腸細(xì)胞的上皮細(xì)胞頂膜特異蛋白結(jié)合并形成腸穿孔，從而破壞細(xì)胞的滲透平衡，引起細(xì)胞腫脹裂解，最終導(dǎo)致死亡。因此Vip3基因已成為植物基因工程及轉(zhuǎn)基因育種應(yīng)用中最具有潛力和應(yīng)用前景的抗蟲基因。其中Vip3Aa基因已成功的被用于轉(zhuǎn)基因棉花和玉米。

但是在轉(zhuǎn)基因作物的飛速發(fā)展在帶來巨大經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí)，人們也越來越關(guān)注轉(zhuǎn)基因作物可能帶來的不可預(yù)期的食用安全及環(huán)境安全性問題，越來越多的國家要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行檢測以實(shí)行標(biāo)識制度。

目前在檢測轉(zhuǎn)基因玉米中抗蟲蛋白Vip3Aa20的酶聯(lián)免疫試劑盒方面，美國envirologix只有定性檢測試劑盒，國內(nèi)外尚未有定量檢測試劑盒的報(bào)道。

公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供定量檢測轉(zhuǎn)基因玉米中抗蟲蛋白Vip3Aa20的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，其具有操作簡便、能同時(shí)快速檢測大批樣品，具有高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種定量檢測轉(zhuǎn)基因玉米中抗蟲蛋白 Vip3Aa20的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述酶聯(lián)免疫試劑盒由包被捕獲抗體的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、生物素標(biāo)記的檢測抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素、生物素標(biāo)記的抗體稀釋液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素稀釋液、濃縮洗滌液、底物溶液、終止液和板貼組成。

其中，樣品處理液的配方為：

生物素標(biāo)記的檢測抗體：100μg/mL生物素標(biāo)記的Vip3Aa20 1F9-1F5鼠單抗(PBS,50％甘油)溶液；

標(biāo)準(zhǔn)品：2ng的His-Vip3Aa20重組蛋白(凍干粉)，所述His-Vip3Aa20 重組蛋白是通過將Vip3Aa20編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序，鑒定正確以后與 pET28a質(zhì)粒連接，將重組表達(dá)載體pET28a-vip3Aa20轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，保存的重組蛋白Vip3Aa20表達(dá)菌株復(fù)蘇培養(yǎng)，用IPTG 于16℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，并通過重組蛋白純化得到；

辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素：1:40辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase)標(biāo)記的親和素(avidin)母溶液(金開瑞公司)，工作液以1:100 倍稀釋；

生物素標(biāo)記的抗體稀釋液/辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素稀釋液配方：

濃縮洗滌液：含有1.0％Tween-20的10×PBS；

底物溶液：0.5mL 2mg/mL TMB無水乙醇溶液，10mL底物緩沖液，32μL 30％H₂O₂混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；

終止液：1M H₂SO₄。

所述試劑盒的特性：

1)靈敏度為：10.242pg/mL

2)精密度：批內(nèi)差CV％<8％，批間差CV％<10％

3)特異性：本試劑盒特異性檢測vip3A，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

上述酶聯(lián)免疫試劑盒在另一種實(shí)施方式中，所述的捕獲抗體由保藏號為 CGMCC No.14733的雜交瘤細(xì)胞株2G3-1D7分泌得到的，

上述酶聯(lián)免疫試劑盒在另一種實(shí)施方式中，捕獲抗體檢測范圍： 0.03125ng/mL-2ng/mL。

上述酶聯(lián)免疫試劑盒在另一種實(shí)施方式中，所述檢測抗體由保藏號為 CGMCC No.14725的雜交瘤細(xì)胞株1F9-1F5分泌得到。