[發(fā)明專利]定量檢測轉基因玉米中抗蟲蛋白Vip3Aa20的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法

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• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN107894510A
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發(fā)明（設計）人: 劉衛(wèi)曉;李亮;金蕪軍;宛煜嵩;黃衛(wèi)紅;苗朝華;高進;董美;王迪;胡曉穎;安娜
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院生物技術研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司11279
• 代理人: 葉立濤,周際

1.一種定量檢測轉基因玉米中抗蟲蛋白Vip3Aa20的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述酶聯(lián)免疫試劑盒由包被捕獲抗體的微孔反應板、樣品處理液、生物素標記的檢測抗體、標準品、辣根過氧化物酶標記的親和素、生物素標記的抗體稀釋液、辣根過氧化物酶標記的親和素稀釋液、濃縮洗滌液、底物溶液、終止液和板貼組成；

其中，樣品處理液的配方為：1M Tris,pH 7.5 500uL，1M NaCL 1.5mL，0.5M EDTA 20uL，50％甘油 2mL，10％SDS 1mL，用雙蒸水配成10ML，使用時添加1片蛋白酶抑制劑以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；

生物素標記的檢測抗體為100μg/mL生物素標記的Vip3Aa20 1F9-1F5鼠單抗(PBS,50％甘油)溶液；

標準品為2ng的His-Vip3Aa20重組蛋白；

辣根過氧化物酶標記的親和素為1:40辣根過氧化物酶標記的親和素溶液；

生物素標記的抗體稀釋液以及辣根過氧化物酶標記的親和素稀釋液配方為1％BSA 1g，0.05％的吐溫20 0.05mL，0.1％的NaN₃ 0.1mL，最終用1×PBS定容至100mL；

濃縮洗滌液為含有1.0％Tween-20的10×PBS；

底物溶液為0.5mL 2mg/mL TMB無水乙醇溶液，10mL底物緩沖液，32μL 30％H₂O₂混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；

終止液為1M H₂SO₄。

2.根據權利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述的捕獲抗體由保藏號為CGMCC No.14733的雜交瘤細胞株2G3-1D7分泌得到的。

3.根據權利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，捕獲抗體的檢測范圍0.03125ng/mL-2ng/mL。

4.根據權利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述檢測抗體由保藏號為CGMCC No.14725的雜交瘤細胞株1F9-1F5分泌得到。

5.一種定量檢測轉基因玉米中抗蟲蛋白Vip3Aa20的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)將權利要求1所述的樣品處理液、生物素標記的檢測抗體、標準品、辣根過氧化物酶標記的親和素、生物素標記的抗體稀釋液、辣根過氧化物酶標記的親和素稀釋液、濃縮洗滌液、底物溶液、終止液置于18-25℃，平衡至少30分鐘；

2)分別設標準品孔、待測樣本孔，在每孔中加入標準品或待測樣本進行溫育，然后棄去液體，甩干后加入生物素標記的檢測抗體工作液進行溫育，棄去孔內液體，洗滌甩干后每孔加入辣根過氧化物酶標記的親和素工作液，進行溫育，棄去孔內液體，洗滌甩干后每孔加入底物溶液，避光顯色后每孔加入終止溶液，混勻在反應終止后5分鐘內用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度OD值；

3)數據處理：將標準品及樣本值減去S0孔數值后繪制曲線，如果設置復孔，則取其平均值計算，以標準品的濃度為縱坐標，OD值為橫坐標，繪出標準曲線，根據樣本OD值，由標準曲線查出相應的濃度。

6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，生物素標記的檢測抗體工作液是通過將生物素標記的檢測抗體液用生物素標記的抗體稀釋液按1:100倍進行稀釋得到的。

7.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，辣根過氧化物酶標記的親和素工作液是通過將辣根過氧化物酶標記的親和素用辣根過氧化物酶標記的親和素稀釋液按1:100倍進行稀釋得到的。

8.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，在步驟2)中，每孔分別加標準品或待測樣本80-120μL，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37℃溫育1.5-2.5小時；棄去液體，甩干，不用洗滌；每孔加生物素標記抗體工作液80-120μL，覆上新的板貼，37℃溫育0.5-1.5小時；棄去孔內液體，甩干，洗板2-4次，每次浸泡1-3分鐘，150-250μL/每孔，甩干；每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液80-120μL，覆上新的板貼，37℃溫育0.5-1.5小時；棄去孔內液體，甩干，洗板4-6次，每次浸泡1-3分鐘，150-250μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液80-100μL，37℃避光顯色15-30分鐘；依序每孔加終止溶液50μL，終止反應。