[發明專利]一種面包樹果實凝集素的提取方法

有效

• 申請號: 201711327644.1
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN107827965B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 楊愈豐;張曉青;施青;劉振勇;李均;彭莉萍
• 申請（專利權）人: 遵義醫科大學
• 主分類號: C07K14/42
• 分類號: C07K14/42;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18
• 代理公司: 重慶強大凱創專利代理事務所(普通合伙) 50217
• 代理人: 黃書凱

1.一種面包樹果實凝集素的提取方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）原料制備：從新鮮的面包樹果實中取果實籽，得新鮮原料；

（2）打漿：在新鮮原料中加入Tris-HCl緩沖液，經勻漿機打碎得漿狀原料；Tris-HCl緩沖液的pH為7.2，Tris-HCl緩沖液含0.02mol/L Tris和0.2mol/L NaCl；

（3）熱水浴浸提：在40～60℃的條件下對漿狀原料浸提1～2h，浸提后過濾得濾液；

（4）第一次離心：在4000～8000r/min的條件下對濾液離心處理15～30min，然后取上清液；

（5）硫酸銨沉淀目的蛋白：在上清液中加入硫酸銨至飽和度為70～90％，靜置2～8h得懸濁液；

（6）第二次離心：在4000～8000r/min的條件下對懸濁液離心處理15～30min，棄上清液，沉淀用Tris-HCl緩沖液重懸，得面包樹果實凝集素粗品；

（7）透析除鹽：將步驟（6）中的面包樹果實凝集素粗品在截留分子量為7kDa的透析袋中用超純水透析12～24h，得面包樹果實凝集素樣品；透析除鹽時，扎緊透析袋兩端，把透析袋放入盛有超純水的攪拌容器中，以60～120r/min進行攪拌，水溫為18～60℃，透析袋體積/超純水體積為1:7～1:20；

（8）陽離子交換層析：將所述面包樹果實凝集素樣品上陽離子交換柱，用Buffer A和Buffer B梯度洗脫，收集25%～30%Buffer B的洗脫組分；Buffer A為濃度20mmol/L、經濃HCl調節pH值至6.5的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄溶液；Buffer B為經濃HCl調節pH值至6.5的溶液，溶液中包含為濃度20mmol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄和0.5mol/L NaCl；梯度洗脫時包括以下過程：①打開AKTA純化儀用超純水沖洗管路，去除管路保護液；②裝柱：調節柱前壓至0.5MPa，將5mL HiTrap SP預裝柱接到AKTA純化儀上，用超純水沖洗至基線平衡；③柱子平衡：用Buffer A沖洗柱子至基線平衡，流速為2mL/min；④上樣：將紫外調零，按流速2mL/min，上樣結束后，用Buffer A沖洗直到基線水平為止；⑤洗脫：設置洗脫時間為10min，使用0-100%的Buffer B進行連續梯度洗脫；

（9）超濾濃縮洗脫：將陽離子交換層析中收集的洗脫組分用截留分子量為10KDa的超濾濃縮管進行離心處理得到面包樹果實凝集素超濾濃縮液，離心轉速為4000～8000r/min。