[發明專利]一種動物精子活動度測定前的預處理方法及其應用

在審

• 申請號: 201711327639.0
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN109913406A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 鄭明嵐;潘曉靚;張挺;王小康;常艷
• 申請（專利權）人: 上海益諾思生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076;C12Q1/02
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;朱水平

本發明公開了一種動物精子活動度測定前的預處理方法及其應用。所述預處理方法包括以下步驟：(1)迅速取死亡動物的附睪尾部置于(37±1)℃、pH為6.8～7.0的精子孵育液中；所述精子孵育液為含0.3～0.7％牛血清蛋白的無血清培養液，所述百分比為質量體積百分比；(2)將所述附睪尾部剪碎，于所述精子孵育液中恒溫孵育2～5分鐘后混勻，得精子懸浮液。本發明通過優化精子孵育液的配方、pH以及對精子孵育的時間，使得精子活動度檢測更加快速、準確，并且測定的重復性好。

技術領域

本發明涉及精子檢測領域，具體涉及一種動物精子活動度測定前的預處理方法及其應用。

背景技術

近年來，隨著雄性生殖毒理研究的深入，提出了以精子形態結構和精子運動能力等作為雄性生殖功能影響重要觀察指標。精子的運動能力是精子結構變化和功能狀況的綜合體現，是完成受精過程的基礎，在雄性生殖毒理學研究中都把其作為衡量精液質量的主要指標之一。精子運動功能參數中，精子活力下降會導致生育率下降。因此，精子的運動能力可作為男(雄)性生殖毒性評價的早期敏感指標。精子活力測定方法的優化對雄性生殖毒理學研究有十分重要的意義。

影響精子代謝和生活力的因素很多，防止有害因素，正確利用有利因素,使精子保存在合適的環境之中，延長其保存時間十分關鍵。影響精子運動和存活時間的重要因素是溫度、滲透壓和pH。37℃～38℃是保持精子正常運動的適宜溫度，隨著溫度的逐漸升高，精子的活動能力和代謝作用逐漸加強，能量消耗逐漸加快，存活時間開始縮短。例如溫度超過50℃時，精子在5min之內就會不可逆地喪失活動力，而且大多數細胞能夠被剛果紅染色；在室溫20℃和體溫37℃之間，精子活動力的差異十分明顯，因此，在恒溫條件下評定精液的品質，就顯得就十分重要了。滲透壓也是影響精子在體外活動度的重要因素，精子只有在等滲溶液中才能保持正常的形態和生活力。在低滲溶液中水分通過細胞膜進入精子細胞內，使精子膨脹，尾部發生環狀或者半圓形彎曲，搖擺運動，很快死亡。在高滲溶液中精子內水分向外彌散，精子皺縮，尾部發生鋸齒狀彎曲，運動緩慢，最后死亡。因此，在精液稀釋時，配置等滲的精子稀釋液十分關鍵，所用稀釋液都是等滲的(通常情況下，精液是與6.9％的葡萄糖溶液等滲的)，配置劑量要準確，操作時防止精液與水接觸。如上所述，精子在體外的活動度受到多種因素的影響，在保存和稀釋精液時，特別要考慮到精液的酸堿度，然而目前在本領域內適于精子體外孵育的pH值的范圍目前并沒有統一的標準。

發明內容

本發明為克服現有技術當中精子活動度測定的方法耗時長、準確性低且重復性不好的缺陷，提供一種動物精子活動度測定前的預處理方法及其應用。所述預處理方法通過優化精子孵育液的配方、pH以及對精子孵育的時間，使得精子活動度檢測更加快速、準確，并且測定的重復性好。

本發明提供一種動物精子活動度測定前的預處理方法，其包括以下步驟：

(1)迅速取死亡動物的附睪尾部置于(37±1)℃、pH為6.8～7.0的精子孵育液中；所述精子孵育液為含0.3～0.7％牛血清蛋白的無血清培養液，所述百分比為質量體積百分比；

(2)將所述附睪尾部剪碎，于所述精子孵育液中恒溫孵育2～5分鐘后混勻，得精子懸浮液。若所述恒溫孵育時間小于2分鐘精子不能充分游離出來，若大于5分鐘則精子活力下降。

其中，步驟(1)中所述的無血清培養液可為本領域常規的無血清培養液，較佳地為RPMI1640或者DMEM。根據本發明，RPMI1640和DMEM均含有細胞培養所需要的基本培養成分，同樣適于本發明中精子的孵育。

步驟(1)中所述的精子孵育液較佳地為含0.5％牛血清蛋白的無血清培養液，所述百分比為質量體積百分比。當所述精子孵育液中所含牛血清蛋白的質量體積百分比低于0.3％或者高于0.7％時，牛血清蛋白不能起到生理和機械保護作用以及載體作用。

步驟(2)中所述恒溫孵育的時間不超過3分鐘。