[發明專利]一種對硝基芐醇丙二酸單酯的生物制備方法

有效

• 申請號: 201711326065.5
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN108060186B
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發明（設計）人: 楊仲毅;鐘永軍;何昕蔚;羅希;蔣晶晶;余達勇
• 申請（專利權）人: 臺州學院
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 賈師英

本發明提供了一種通過雙酶催化制備對硝基芐醇丙二酸單酯的方法，包括如下步驟：以2?氰基乙酸?(4?硝基苯基)甲酯為底物，用糞產堿桿菌來源的腈水解酶和糞產堿桿菌來源的酰胺酶進行聯合催化而得。本發明方法的產物收率高，副產物少，反應條件溫和，且環境污染小，適用于工業化生產。

技術領域

本發明屬于生物催化技術領域，具體地說，涉及通過腈水解酶與酰胺酶的聯合催化來制備對硝基芐醇丙二酸單酯的方法。

背景技術

式I所示化合物對硝基芐醇丙二酸單酯(或稱對硝基芐醇丙二酸單酸酯)是一種多用途的藥物中間體，比如是制備美羅培南的重要原料，其英文名為Mono-4-nitrobenzylMalonate，CAS號為77359-11-6，具有較高的市場需求量和廣泛的用途。

對硝基芐醇丙二酸單酯的制備方法主要是化學合成法。化學合成方法比如是以丙二酸和對硝基芐醇為原料，經過酯化、堿酸調和精制等步驟制得(參見發明專利US5087734)。然而，化學合成方法能耗大，后處理程序復雜，產物純度低，易造成環境污染。生物酶催化法具有反應條件溫和、催化效率高、環境污染少等突出優點，越來越引起人們的重視。目前的生物酶催化法制備路線是以對硝基芐醇、丙二酸或丙二酸鹽為底物，在脂肪酶的催化作用下形成(參見發明專利CN201310454873.5)。但是該方法容易產生副產物丙二酸二對硝基芐酯，降低了產物的純度。因此，需要進一步研發一種更為綠色、高效、專一性強的酶催化法。

腈水解酶(nitrilase)是生物化工領域中一種重要的酶催化劑，它能直接將腈類化合物中的氰基直接轉化為羧基進而獲得羧酸。腈水解酶具有很強的底物特異性，對于不同的底物，其催化效率和立體選擇性等性能差異很大。受限于底物的結構特異性，對于給定的某一底物，不同的腈水解酶在活性和選擇性等方面差異很大。發明人研究發現，當腈水解酶催化式II所示底物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯反應時，會顯示出較強的腈水合酶活性，得到的主要產物不是式I所示的羧酸化合物，而是式III所示酰胺副產物3-氨基-3-氧代丙酸-(4-硝基苯基)甲酯。由于目的產物即化合物I收率低，該方法不具有經濟性。

因此，如何避免式III所示酰胺副產物的產生，提高化合物I的收率，成為腈水解酶催化法制備對硝基芐醇丙二酸單酯的關鍵問題。

發明內容

為了克服現有技術的不足，發明人對腈水解酶催化法進行了深入研究，發現腈水解酶與酰胺酶的組合能夠解決上述問題，從而開發出一種產物收率顯著提高、底物濃度提高的雙酶催化工藝路線。

具體而言，本發明提供了一種制備對硝基芐醇丙二酸單酯的方法，包括如下步驟：

以式II所示化合物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯為底物，用腈水解酶或者其表達微生物、和酰胺酶或者其表達微生物進行聯合催化而得。

在一種優選的實施方式中，上述腈水解酶是糞產堿桿菌(Alcaligenes faecalis)來源的腈水解酶。

優選地，上述腈水解酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。

MSKVAVIQAASIPFDSVSSVEKAAAILQRVAANGATLAVFPEAFLGGYPKGISFGSVIGNRRPEGRALYQMYVEGAVTLGGPELEALADAVTQTGVYTVMGVIEKMGRTLYCTALTLAPGQGVVGIHRKLMPTGQERLVWGFGDGSTLGTVDTPMGRIGKVICWENYMPALRQTMYAQGTELYCTPTADDRPTWASSMIHIAVEGRVFVLSACQAIRLNNYPESFQKEFALPGEFAPDSYVMHGGSMIVSPTGEVLAGPVFDEETELYAELDMDLLKQANLDFDVYGHYSRPDIFSLHVDTRAKQVVKLQTEDSGE(SEQ ID NO:1)。