[發(fā)明專利]一種檢測辣椒脈斑駁病毒專用引物及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711325020.6
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN107937609B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊彩霞;高芳鑾;付晶晶;韓彤;廖一鳴;李梁;侯秋實;石長玉
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 沈陽技聯(lián)專利代理有限公司 21205
• 代理人: 趙越

1.一種檢測辣椒脈斑駁病毒的專用引物，其特征在于，所述引物的序列具體為：

上游引物：ChiVMV-CP-F：如SEQ ID NO.1 所示，即，5’- GCACCATACATTTCAGAAACAGC-3’，

下游引物：ChiVMV-CP-R：如SEQ ID NO.2 所示，即，5’- GAACCACACTGAAGAATATGRATG-3’，

所述的引物PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物如SEQ ID NO.3所示。

2.一種檢測辣椒脈斑駁病毒方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）提取待檢測龍葵和番茄樣品的總RNA，備用；總RNA的提取方法如下：

采用TRIzol法對植物病葉的總RNA進(jìn)行提取，實驗步驟按照說明書進(jìn)行：

稱量花葉重癥樣品，于液態(tài)氮氣中研磨至完全粉碎，轉(zhuǎn)移Eppendorf管中；

立即加入TRIzol，室溫放置以裂解細(xì)胞；離心15 min；

取上清液，加入等體積三氯甲烷混合旋渦振蕩，室溫下靜置；離心15 min；

取上清液，加入體積異丙醇，混合均勻冷藏；離心15 min；

棄上清，用無水乙醇洗滌沉淀；離心15 min；

棄上清，室溫干燥，加入RNase-free H₂O溶解，冰上備用，-80℃凍存；

（2）依據(jù)TIANScript RT Kit cDNA第一條鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

混合均勻，42℃溫浴，反應(yīng)結(jié)束后于95℃下溫浴以終止反應(yīng)，待溫度降至室溫后加入RNase-Free ddH₂O稀釋備用；

其中，PCR引物如權(quán)利要求1所示；

PCR擴(kuò)增時采用25μL體系，體系設(shè)計如下：

cDNA，3μl；

上游引物，1μl；

下游引物，1μl；

dNTP，1μl；

10*Taq Buffer，2.5μl；

Taq，0.2μl；

補(bǔ)滅菌水至25μl；

反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，54℃退火40s，72℃延伸40s，實驗進(jìn)行40個循環(huán)，72℃終延伸7min；

（3）對（2）中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到陽性條帶，目的條帶大小為1,103bp，經(jīng)測序后進(jìn)行Blast比對，表明樣品中含有辣椒脈斑駁病毒；

（4）為進(jìn)一步確定樣品是否受到辣椒脈斑駁病毒侵染，將（3）中待檢測PCR 產(chǎn)物樣品進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物直接與PMD20-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到DH-5α菌株中培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌液復(fù)蘇，并對復(fù)蘇后的菌液進(jìn)行菌液PCR初步鑒定，對陽性菌株進(jìn)行進(jìn)一步測序，依據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行比對，進(jìn)一步確定樣品是否被辣椒脈斑駁病毒侵染。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測辣椒脈斑駁病毒方法，其特征在于，

cDNA第一條鏈合成的體系如下：

2μl M4-T18；

2μl Super Pure dNTPs，其濃度為2.5mmol；

3μl RNA；

補(bǔ)RNase-Free ddH₂O至14.5μl；

4μl 5×First-Strand buffer；

0.5μl RNase抑制劑，其濃度為20 U?μL^-1；

1μl TIANScript M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，其濃度為200U?L^-1。