[發明專利]一種通過PCR技術判定土豆是否輻照的方法

有效

• 申請號: 201711324950.X
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN108130361B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 劉綿學;黃敏;伏毅;王艷;瞿攀
• 申請（專利權）人: 四川省原子能研究院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 成都天嘉專利事務所(普通合伙) 51211
• 代理人: 史姣姣

1.一種鑒定待測土豆樣本DNA損傷是否符合輻照特征的方法，其特征在于：所述方法包括下述步驟：

A、提取樣本總DNA：

取同一批次的未輻照土豆樣本、同一批次待檢土豆樣本至少各三個，分別提取每個樣本的總DNA；

B、獲取未輻照土豆樣本總DNA中待檢測核酸片段之間分布數量的相對倍數的對數的平均數：

將步驟A中提取的每個未輻照土豆樣本總DNA采用引物對組合進行實時定量PCR檢測，通過Livak分析，分別得到至少3個未輻照樣本土豆總DNA中待檢測片段之間分布數量的相對倍數的對數，并計算得到未輻照土豆樣本總DNA中待檢測核酸片段之間分布數量的相對倍數的對數的平均數；

所述引物對組合如下：

P1-P2引物對組合，其序列為：

P1：5’ATTCGGCCTAGCTCTGTGAC 3’，5’TGAGATGCCCAACTGCATGA 3’；

P2：5’AACGATGAGTGTTCGCCCTT 3’，5’GGCAATCTTTCCGGATTCGC 3’；

P3-P4引物對組合，其序列為：

P3：5’AGCACTACCGGTGGAAGGTA 3’，5’TTAGCCAAAGGTCGCTTGGA 3’；

P4：5’ACGGGAAATTGTCCGCGATA 3’，5’AAAATCAGGCAACGGTCCCA 3’；

C、獲取鑒定方法檢出限；所述鑒定方法檢出限為空白標準偏差的3倍；

D、按照步驟B獲取待檢土豆樣本總DNA中待檢測核酸片段之間分布數量的相對倍數的對數；

E、鑒定待測土豆樣本DNA損傷是否符合輻照特征：

當采用P1-P2引物對組合、P3-P4引物對組合中任意一組或2組獲得的待檢土豆樣本待檢測片段分布數量的相對倍數的對數與未輻照土豆對應組合的相對倍數的對數的平均數的差的絕對值大于空白標準偏差的3倍時，待檢土豆樣本DNA損傷不符合輻照特征；

當采用P1-P2引物對組合和P3-P4引物對組合獲得的待檢土豆的兩個相對倍數值的對數與未輻照土豆對應組合的相對倍數的對數的平均數的差的絕對值同時小于等于空白標準偏差的3倍，待測土豆樣本DNA損傷符合輻照特征；

所述土豆樣本DNA損傷由加熱、凍融或輻照造成的；

其中，所述土豆總DNA中待檢測核酸片段之間分布數量的相對倍數等于：以2為底，以引物對組合中的兩對引物定量PCR得到的初始循環數的差的絕對值為指數的指數函數值；

所述對數是以2為底的對數函數；

在步驟C中，所述空白標準偏差是指PCR鑒定方法的空白標準偏差，獲取空白標準偏差是按照步驟B操作，以未輻照土豆總DNA為模板，采用所述引物對組合中的任意一對引物 進行至少20個相同的實時定量PCR反應，計算初始循環數結果的標準偏差，得到空白標準偏差。

2.根據權利要求1所述的鑒定待測土豆樣本DNA損傷是否符合輻照特征的方法，其特征在于：所 述提取樣本總DNA的方法是將樣本液氮處理并碾磨土豆組織，然后使用乙醇沉淀或吸附柱 回收，總DNA溶于純水或PE緩沖液后，50-65℃金屬浴或水浴10min，去除殘留乙醇得到樣本 總DNA。

3.根據權利要求1所述的鑒定待測土豆樣本DNA損傷是否符合輻照特征的方法，其特征在于：所述實時定量PCR的反應體系為10或20μL/管，PCR程序為預變性95.0℃2min，變性95.0℃5s，復性延伸60.0℃30s，40次重復，再次變性95.0℃5s，溶解曲線溫度范圍65℃-95℃，升溫速度 0.5℃/5s。