[發(fā)明專利]檢測(cè)MSI的非診斷方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711324469.0
• 申請(qǐng)日: 2017-12-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108070658B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 臧國(guó)梁;郎繼東;梁羽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 元碼基因科技（北京）股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/686;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京科石知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11595
• 代理人: 高元吉

本發(fā)明公開(kāi)檢測(cè)MSI的非診斷方法。從血液分離血漿和白細(xì)胞，并提取血漿中的ctDNA，和白細(xì)胞中的gDNA；分別以ctDNA和gDNA為模板建立測(cè)序文庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)并測(cè)序；在測(cè)序文庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)中分別確定各位點(diǎn)中重復(fù)單元的序列，并分別統(tǒng)計(jì)各序列長(zhǎng)度，計(jì)算各序列長(zhǎng)度的相對(duì)頻率分布，去除序列長(zhǎng)度等于300bp及測(cè)序文庫(kù)與標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)共有的序列長(zhǎng)度的相對(duì)頻率，以各位點(diǎn)在測(cè)序文庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)中的相對(duì)頻率繪制分布曲線，根據(jù)兩條曲線是否趨勢(shì)一致判斷是否存在MSI。本發(fā)明的方法能夠有效檢測(cè)血液中腫瘤細(xì)胞的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)，而不依賴于腫瘤組織，從而減輕患者取樣時(shí)的痛苦，檢測(cè)方便快捷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明通常涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別地涉及微衛(wèi)星重復(fù)序列長(zhǎng)度改變的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

微衛(wèi)星(MS)為廣泛分布于原核及有核細(xì)胞生物且由1-6個(gè)核苷酸組成的，具有高度多態(tài)性的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列。盡管MS在個(gè)體之間存在高度的多態(tài)性，但在個(gè)體內(nèi)部保持一定的遺傳穩(wěn)定性(孟德?tīng)柟诧@性遺傳)，因此，MS是重要的一類遺傳標(biāo)記，可以用于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷。位于編碼區(qū)的MS易于出現(xiàn)復(fù)制滑脫(比一般編碼區(qū)中其他基因的發(fā)生概率高10～100倍)，當(dāng)突變、缺失或者表觀沉默導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)(MMR)基因失去功能，從而不能修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中滑動(dòng)鏈與互補(bǔ)堿基出現(xiàn)的錯(cuò)配，導(dǎo)致一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)的堿基插入或缺失，進(jìn)而產(chǎn)生MSI表型。

目前臨床主要采用多重?zé)晒釶CR結(jié)合毛細(xì)管電泳進(jìn)行MSI檢測(cè)，通過(guò)擴(kuò)增正常組織和腫瘤組織DNA，將等位基因譜進(jìn)行比較分析，如果腫瘤樣本DNA的等位基因出現(xiàn)異常的分型，表明存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定，但是該技術(shù)存在的問(wèn)題如下：(1)檢測(cè)時(shí)要求必須同時(shí)制備腫瘤組織或正常組織(如，癌旁組織)，雖然檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但是腫瘤組織需要手術(shù)或者活檢取材，給患者創(chuàng)傷較大，如果部分患者因身體或其它原因無(wú)法進(jìn)行手術(shù)或穿刺，這就造成患者無(wú)法完成檢測(cè)。(2)腫瘤具有異質(zhì)性，如果取材不當(dāng)，可能導(dǎo)致檢測(cè)假陰性。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種檢測(cè)MSI的非診斷方法，可以不依賴于腫瘤組織，只抽取患者血液即可完成檢測(cè)。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

一種檢測(cè)MSI的非診斷方法，其包括以下步驟：

(1)樣品制備步驟：從血液分離血漿和白細(xì)胞，并提取血漿中的ctDNA作為待檢測(cè)樣品，和白細(xì)胞中的gDNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，其中ctDNA經(jīng)過(guò)agilent 2100生物分析儀檢測(cè)，確保其中g(shù)DNA含量低于ctDNA的1/3。

(2)文庫(kù)構(gòu)建步驟：以所述ctDNA為模板建立測(cè)序文庫(kù)，同時(shí)以所述gDNA為模板建立標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)，其中各文庫(kù)建立時(shí)用于PCR擴(kuò)增的引物組由SEQ ID NO:1-14組成；

(3)文庫(kù)測(cè)序步驟：以相同的方法分別對(duì)測(cè)序文庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序；

(4)測(cè)序結(jié)果的分析步驟，其中包括在測(cè)序文庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)中分別確定各位點(diǎn)中重復(fù)單元的序列，并分別統(tǒng)計(jì)各序列長(zhǎng)度，計(jì)算各序列長(zhǎng)度的相對(duì)頻率分布，去除序列長(zhǎng)度等于300bp及測(cè)序文庫(kù)與標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)共有的序列長(zhǎng)度的相對(duì)頻率，以各位點(diǎn)在測(cè)序文庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)中的相對(duì)頻率繪制分布曲線，并根據(jù)兩條曲線是否趨勢(shì)一致判斷是否存在MSI。

根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，在樣品制備步驟中，使用基于生物芯片的技術(shù)進(jìn)行片段分析來(lái)確保gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3。

根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，所述引物組包括位點(diǎn)引物和性別引物。

根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地，文庫(kù)構(gòu)建包括使用SEQ ID NO:1-14組成的引物組進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，并將純化產(chǎn)物使用非PCR(PCR-Free)方式(包括末端修復(fù)、加A和接頭連接)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。