[發明專利]檢測MSI的非診斷方法

有效

• 申請號: 201711324469.0
• 申請日: 2017-12-13
• 公開（公告）號: CN108070658B
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 臧國梁;郎繼東;梁羽
• 申請（專利權）人: 元碼基因科技（北京）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12Q1/6869;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京科石知識產權代理有限公司 11595
• 代理人: 高元吉

1.一種檢測MSI的非診斷方法，其包括以下步驟：

(1)樣品制備步驟：從血液分離血漿和白細胞，并提取血漿中的ctDNA作為待檢測樣品，和白細胞中的gDNA作為標準樣品；其中所述gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3；

(2)文庫構建步驟：以所述ctDNA為模板建立測序文庫，同時以所述gDNA為模板建立標準文庫，其中各文庫建立時用于PCR擴增的引物組由SEQ ID NO:1-14組成；

(3)文庫測序步驟：以相同的方法分別對所述測序文庫和所述標準文庫進行測序；

(4)測序結果的分析步驟，其中包括在所述測序文庫和所述標準文庫中分別確定各位點中重復單元的序列，并分別統計各序列長度，計算各序列長度的相對頻率分布，去除序列長度等于300bp及所述測序文庫與所述標準文庫共有的序列長度的相對頻率，以各位點在所述測序文庫和所述標準文庫中的相對頻率繪制分布曲線，并根據兩條曲線是否趨勢一致判斷是否存在MSI。

2.根據權利要求1所述的非診斷性方法，其中在所述樣品制備步驟中，使用生物芯片進行片段分析來確保所述gDNA的含量低于所述ctDNA的1/3。

3.根據權利要求1所述的非診斷性方法，其中所述引物組包括位點引物和性別引物。

4.根據權利要求1所述的非診斷性方法，其中所述文庫構建步驟包括使用SEQ ID NO:1-14組成的引物組進行多重PCR擴增，得到擴增產物，純化所述擴增產物，得到純化產物，并使用非PCR方式利用所述純化產物進行文庫構建。

5.根據權利要求1所述的非診斷性方法，其中所述文庫構建步驟包括在引物末端添加文庫接頭。

6.根據權利要求5所述的非診斷性方法，其中在各位點的正向引物的5’端添加SEQ IDNO:15所示的序列，并在各位點的反向引物5’端添加SEQ ID NO:16所示的序列。

7.根據權利要求6所述的非診斷性方法，其中進一步包括以ctDNA或gDNA為模板，使用添加文庫接頭的引物進行雜交和目標區域連接，生成雜交鏈；然后以所述雜交鏈為模板進行PCR擴增。

8.根據權利要求7所述的非診斷性方法，其中所述文庫構建步驟中的PCR擴增時所使用的引物序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。

9.根據權利要求1所述的非診斷性方法，其中在所述文庫測序步驟中使用高通量測序技術分別對測序文庫和標準文庫進行測序。

10.根據權利要求1所述的非診斷性方法，其中在所述測序結果的分析步驟中，如果各位點在測序文庫和標準文庫的序列長度的相對頻率分布曲線一致，則計數為0，否則計數為1；統計各位點的分數值之和x；當x＝0時，為穩定型，當x＝1時為低頻不穩定型，當x1時為高頻不穩定型。