[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)miRNA?122的熒光生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711324321.7
• 申請(qǐng)日: 2018-02-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107828859A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王玉;張雪;劉素;黃加棟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 濟(jì)南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6825
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6825;C12Q1/682;C12Q1/6883;C12Q1/6886
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所37218
• 代理人: 李桂存

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)miRNA-122的熒光生物傳感器，特別涉及一種基于四步信號(hào)放大技術(shù)的檢測(cè)miRNA-122的熒光生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約20~25個(gè)核苷酸。miRNA-122，其核酸鏈堿基順序是5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’。研究表明，miRNA-122 是由定位于人類(lèi)第18號(hào)染色體上的HCR基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，其不僅能夠影響肝細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程，而且在肝細(xì)胞的表型、分化代謝以及細(xì)胞應(yīng)答等諸多生命活動(dòng)中也發(fā)揮著極其重要的作用。隨著對(duì)miRNA-122研究的深入，科研工作者還發(fā)現(xiàn)miRNA-122能夠促進(jìn)肝細(xì)胞中丙型肝炎病毒（HCV）的復(fù)制并且其過(guò)量表達(dá)與肝癌的發(fā)生緊密相關(guān)。

目前報(bào)道的MiRNA的檢測(cè)方法主要有定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和Northern blotting法、克隆測(cè)序法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，但實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)溫度和儀器要求較高，專(zhuān)業(yè)技術(shù)要求高；Northern blotting法耗時(shí)、過(guò)程復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度不高，克隆測(cè)序法也是耗時(shí)耗力。因此，目前急需建立一種快速，準(zhǔn)確，靈敏且高特異性的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)miRNA-122。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)目前缺乏快速，準(zhǔn)確，靈敏且高特異性的檢測(cè)miRNA-122的方法等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種檢測(cè)miRNA-122的熒光生物傳感器，其檢測(cè)過(guò)程通過(guò)四步信號(hào)放大，顯著提高了檢測(cè)靈敏度。

本發(fā)明的另一目的是提供一種上述熒光生物傳感器在快速檢測(cè)miRNA-122中的應(yīng)用，成本低、周期短、特異性好、靈敏度高。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種檢測(cè)miRNA-122的熒光生物傳感器，包括以下成分：發(fā)夾探針，輔助探針，分子信標(biāo)，環(huán)形模板，phi29聚合酶，Nt.BbvCI酶，dNTPs和緩沖液；

所述發(fā)夾探針的序列如SEQ No. 1所示；

輔助探針的序列如SEQ No. 2所示；

分子信標(biāo)的序列如SEQ No. 3所示，其5’端和3’端分別修飾有熒光基團(tuán)和相應(yīng)熒光猝滅基團(tuán)；所述熒光基團(tuán)優(yōu)選為6-羧基熒光素（FAM），所述相應(yīng)熒光猝滅基團(tuán)優(yōu)選為4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸（Dabcyl）；

所述環(huán)形模板為單鏈環(huán)形DNA，序列如SEQ No. 4所示，其5’端修飾有磷酸基團(tuán)。

所述miRNA-122的序列如SEQ No.5所示。

上述環(huán)形模板優(yōu)選的制備方法，包括以下步驟：

（1）將掛鎖探針與連接探針在T4 DNA連接酶緩沖液中雜交，然后加入T4 DNA連接酶低溫下反應(yīng)，然后滅活T4 DNA連接酶；

（2）上述體系中加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ反應(yīng)，然后滅活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，純化后得環(huán)形模板；

所述掛鎖探針的序列如SEQ No. 4所示，其5’端修飾有磷酸基團(tuán)；連接探針的序列如SEQ No. 6所示。

所述T4 DNA連接酶的反應(yīng)溫度為16-20℃，反應(yīng)時(shí)間為12-20h。

所述步驟（1）和（2）中滅活酶的步驟為高溫滅活；滅活T4 DNA連接酶的條件優(yōu)選為65℃下15min；滅活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ的條件優(yōu)選為85℃下10min。

所述純化的步驟為以乙醇或異丙醇沉淀后離心，棄沉淀，上清即環(huán)形模板；加入量?jī)?yōu)選為步驟（2）液體體系的1體積倍；乙醇濃度優(yōu)選為70-90%（v/v）。

所述T4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液含有50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，10mM二硫蘇糖醇（DTT）和1mM ATP。

一種上述熒光生物傳感器的檢測(cè)miRNA-122的方法，包括以下步驟：

（a）將發(fā)夾探針，輔助探針，10×NEBuffer 2，dNTPs，環(huán)形模板，分子信標(biāo)，phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI酶加入EP管中，再加入待測(cè)液或miRNA-122系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行反應(yīng)；

（b）高溫滅活酶；

（c）熒光檢測(cè)和計(jì)算：進(jìn)行熒光檢測(cè)，根據(jù)miRNA-122系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度計(jì)算溶液濃度常用對(duì)數(shù)-熒光強(qiáng)度回歸曲線和回歸方程，計(jì)算待測(cè)液中miRNA-122濃度。

所述步驟（a）中反應(yīng)條件優(yōu)選為37℃下1-2h。