[發明專利]一種檢測miRNA?122的熒光生物傳感器及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201711324321.7
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN107828859A
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發明（設計）人: 王玉;張雪;劉素;黃加棟
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825;C12Q1/682;C12Q1/6883;C12Q1/6886
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所37218
• 代理人: 李桂存

1.一種檢測miRNA-122的熒光生物傳感器，其特征在于，包括以下成分：發夾探針，輔助探針，分子信標，環形模板，phi29聚合酶，Nt.BbvCI酶，dNTPs和緩沖液；

所述發夾探針的序列如SEQ No. 1所示；

輔助探針的序列如SEQ No. 2所示；

分子信標的序列如SEQ No. 3所示，其5’端和3’端分別修飾有熒光基團和相應熒光猝滅基團；所述熒光基團優選為6-羧基熒光素（FAM），所述相應熒光猝滅基團優選為4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸（Dabcyl）；

所述環形模板為單鏈環形DNA，序列如SEQ No. 4所示，其5’端修飾有磷酸基團；

所述miRNA-122的序列如SEQ No.5所示。

2.根據權利要求1所述的熒光生物傳感器，其特征在于，所述環形模板采用以下方法制備：

（1）將掛鎖探針與連接探針在T4 DNA連接酶緩沖液中雜交，然后加入T4 DNA連接酶低溫下反應，然后滅活T4 DNA連接酶；

（2）上述體系中加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ反應，然后滅活核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，純化后得環形模板；

所述掛鎖探針的序列如SEQ No. 4所示，其5’端修飾有磷酸基團；連接探針的序列如SEQ No. 6所示。

3.根據權利要求2所述熒光生物傳感器，其特征在于，T4 DNA連接酶的反應溫度為16-20℃，反應時間為12-20h。

4.根據權利要求2所述熒光生物傳感器，其特征在于，所述步驟（1）和（2）中滅活酶的步驟為高溫滅活。

5.根據權利要求2所述熒光生物傳感器，其特征在于，所述純化的步驟為以乙醇或異丙醇沉淀后離心，棄沉淀，上清即環形模板；加入量優選為步驟（2）液體體系的1體積倍；乙醇濃度優選為70-90%（v/v）。

6.一種利用如權利要求1-4任一所述的熒光生物傳感器檢測miRNA-122的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（a）將發夾探針，輔助探針，10×NEBuffer 2，dNTPs，環形模板，分子信標，phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI酶加入EP管中，再加入待測液或miRNA-122系列濃度標準溶液進行反應；

（b）高溫滅活酶；

（c）熒光檢測和計算：進行熒光檢測，根據miRNA-122系列濃度標準溶液的熒光強度計算溶液濃度常用對數-熒光強度回歸曲線和回歸方程，計算待測液中miRNA-122濃度。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（a）中反應條件為37℃下1-2h。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，發夾探針的終濃度為1nM-200nM，分子信標的終濃度為1μM -4μM，環形模板的終濃度為10 nM。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（c）中熒光檢測的條件為：激發波長486nm，發射波長518nm，檢測波長范圍496nm-600 nm。