[發明專利]暗黑鰓金龜內參基因及其應用

有效

• 申請號: 201711321016.2
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN108103203B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 鞠倩;曲明靜;李曉;姜曉靜;杜龍;楊珍;江晨;李建文;曾慶朝
• 申請（專利權）人: 山東省花生研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 山東三邦知識產權代理事務所(普通合伙) 37308
• 代理人: 肖太升;牛繼梅

一種暗黑鰓金龜內參基因，所述內參基因為延伸因子1α(EF1α)、核糖體蛋白S5(RPS5)和真核肽鏈釋放因子3(eRF3)；其中EF1α的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，RPS5的核苷酸序列表如SEQ ID NO:2所示，eRF3的核苷酸序列表如SEQ ID NO:3所示。本發明從多個候選內參基因中篩選出表達最穩定的暗黑鰓金龜內參基因，以及基于內參基因序列設計的實時熒光定量PCR引物，解決了現有暗黑鰓金龜熒光定量PCR實驗中沒有可靠內參基因的現狀。篩選出的內參基因適用于分析功能基因在暗黑鰓金龜不同發育階段或不同組織部位的表達水平，能夠提高檢測數據的可靠性、穩定性和重復性。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種暗黑鰓金龜內參基因及其應用。

背景技術

暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)屬節肢動物門，昆蟲綱，鞘翅目，鰓金龜科，是重要的世界性農林業害蟲，在我國危害性具各類金龜子之首。暗黑鰓金龜一年發生一代，一生經歷卵氣、幼蟲期、蛹期、成蟲期四個發育階段，成蟲屬夏季發生型，一般羽化的成蟲在6月上中旬開始發生，8月中下旬結束。成蟲取食榆樹、楊樹、柳樹、槐樹等樹葉，具有暴食性特點。幼蟲主要在地下為害，取食花生、大豆、薯類、麥類等多種作物中的地下部分，常造成作物大面積減產甚至絕收。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術由于其靈敏、準確、低成本、易造作性等優點被廣泛應用于基因表達模式的分析，其中的相對定量方法通常用來檢測目的基因表達量的改變。然而，在qRT-PCR的實際應用中，樣品準備、RNA質量，反轉錄效率等會導致系統性誤差，為了消除這種誤差，通常選擇一個或者幾個表達量恒定的基因作為參照物來歸一化定量PCR的數據。持家基因由于其在維持正常生命活動中的重要性，通常可以在不同細胞或組織穩定表達，故常被選作內參基因，例如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，β-肌動蛋白(β-actin)等。通常有兩種選擇內參基因的方式，第一個是參考其他研究者的相關報道，第二個是選擇近源物種已經應用的持家基因。然而，越來越多的證據表明，通常所認為的可以穩定表達的基因在不同實驗條件下可能出現表達水平的變化，而且這種不穩定性會直接影響檢測實驗結果的準確性和可靠性。由此可見內參基因的選擇是非常重要的。但目前國內外尚未見基于qRT-PCR技術篩選暗黑鰓金龜內參基因并分析其表達穩定性的研究報道。

發明內容

針對上述問題，本發明旨在提供一種暗黑鰓金龜內參基因，并提供了利用該內參基因為基礎設計的實時熒光定量PCR引物。

本發明選擇肌動蛋白1(actin-1)、肌動蛋白2(actin-2)、核糖體蛋白S5(RPS5)、核糖體蛋白S8(RPS8)、延伸因子1α(EF1α)、真核肽鏈釋放因子3(eRF3)、轉錄因子(E2F2)、3-磷酸甘油脫氫酶(GPDH)這8個基因作為候選內參基因，以暗黑鰓金龜的卵、1齡、2齡、3齡幼蟲、蛹、雄性成蟲和雌性成蟲總RNA，以及成蟲的觸角、頭、胸、腹、腿部等部位總RNA為材料分析上述候選內參基因的表達穩定性，為深入研究暗黑鰓金龜基因表達模式提供可靠的內參基因。

一種暗黑鰓金龜內參基因，所述內參基因為延伸因子1α(EF1α)、核糖體蛋白S5(RPS5)和真核肽鏈釋放因子3(eRF3)；其中EF1α的核苷酸序列表如SEQ ID NO:1所示，RPS5的核苷酸序列表如SEQ ID NO:2所示，eRF3的核苷酸序列表如SEQ ID NO:3所示。