[發明專利]一種用于銅綠假單胞菌環介導等溫擴增引物、試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201711319150.9
• 申請日: 2017-12-12
• 公開（公告）號: CN109913561A
• 公開（公告）日: 2019-06-21
• 發明（設計）人: 周勇;項周
• 申請（專利權）人: 重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/385
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本發明屬于病原分子檢測領域，涉及一種銅綠假單胞菌的環介導等溫擴增引物、試劑盒及其檢測方法。所述引物包含根據該菌特異性基因PAK的序列的六個區域設計三對特異引物。所述檢測方法其步驟包括：引物設計；銅綠假單胞菌總DNA提??；環介導等溫擴增反應；環介導等溫擴增反應產物分析：若擴增產物變為藍綠色則為銅綠假單胞菌陽性，若擴增產物為黃褐色則為銅綠假單胞菌陰性。所述試劑盒包含上述引物，以及DNA快速提取試劑、陰性對照品、陽性對照品、顯色試劑、Bst DNA聚合酶、反應液等成分。本發明靈敏度高，檢測下限為10個拷貝的陽性質粒；檢測速率高，僅需1小時即可得到結果；實用性高，不需要昂貴的精密儀器。

技術領域

本發明屬于病原分子檢測領域，涉及一種用于銅綠假單胞菌的環介導等溫擴增引物、試劑盒及其檢測方法。

背景技術

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又稱綠膿桿菌，該菌為條件致病菌，是醫院內感染的主要病原菌之一。經常引起術后傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等，甚至引發敗血癥和菌血癥，嚴重時可導致死亡。銅綠假單胞菌引起的很多感染發生在衰弱或免疫受損的住院病人，它是重癥監護室感染的第二位最常見的病原菌，是呼吸機相關性肺炎的常見原因。除醫院內獲得感染外，HIV感染者很容易在社區獲得該菌的感染，而且一旦被銅綠假單胞菌感染，?？沙霈F晚期HIV感染的體征。并且該病菌還具有多重耐藥的特點，且有先天和后天獲得的耐藥性，其感染后的臨床治療十分困難。因此，開發因此開發快速和靈敏的準確檢測銅綠假單胞菌的方法尤為重要。

目前。在銅綠假單胞菌的檢測方面，傳統純培養、分離及生化鑒定等多個步驟，操作繁瑣，檢測周期長，準確度低。而PCR鑒定需要測序和比對，耗時較長，一般要 5 天左右。兩種檢測方法檢測周期均較長，不能滿足現場快速檢測的需要。環介導等溫擴增，英文名稱為loop-mediated isothermal amplification（LAMP），是2000 年由日本科學家Notomi T.首次在Nucleic Acids Research 雜志上報道的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該方法具有以下特點：具有較強的特異性，只有當引物組與靶序列的6-8個區域都同時匹配上時才能有效擴增；反應體系穩定可靠且有良好的抗干擾能力，在室溫下放置2周后仍然有效，對于樣品中原有的或被污染的干擾片段不敏感，而這是其它核酸擴增技術無法做到的；敏感性較高，擴增快速、高效，1h內擴增產物量可達約1010拷貝數，擴增效率和檢測靈敏度可比普通PCR高10-100倍左右；結果鑒別相對簡便，多樣化，如檢測反應管的沉淀濁度、檢測反應管顏色變化等方法能判斷擴增與否。LAMP技術對于樣品處理、操作技術和儀器設備的要求都比較低，更適宜現場檢測或條件較差的基層使用。

因此，本發明人發明了用于銅綠假單胞菌的環介導等溫擴增引物、試劑盒及其檢測方法。本發明具有靈敏度高，檢測下限為10 個拷貝的陽性質粒；檢測速率高，僅需1 小時即可得到結果；實用性高，不需要昂貴的精密儀器等特點，可實現現場檢測，供給條件較差的基層使用。

發明內容

本發明提供一種快速檢測、特異性好、結果直觀準確的用于銅綠假單胞菌環介導等溫擴增引物，試劑盒及其檢測方法。

本發明技術方案如下：

用于銅綠假單胞菌環介導等溫擴增引物，根據該菌特異性基因PAK的序列的六個區域設計三對特異引物，所述引物如下：

FIP、BIP引物，序列分別為： SEQ ID NO.1～2;

F3、B3引物，序列分別為：SEQ ID NO.3～4;

LF、BF引物，序列分別為：SEQ ID NO.5～6.

進一步地，本發明的銅綠假單胞菌環介導等溫擴增檢測試劑盒，包括上述引物，還包括以下試劑：DNA快速提取試劑、陰性對照品、陽性對照品、顯色試劑、Bst DNA聚合酶及反應液。